ACTIVITY OF KEY GENES AND ENZYMES OF THE ANTIOXIDANT DEFENCE SYSTEM IN PSEUDOMONAS CHLORORAPHIS SUBSP. AURANTIACA

Антиоксидантные ферменты, наряду с системами репарации молекул ДНК, являются основными элементами защиты клеток от активных форм кислорода

Сами продуценты обладают механизмами, позволяющими блокировать токсические эффекты высоких концентраций феназинов. Одним из ключевых механизмов защиты является высокий уровень активности ферментов, разрушающих пероксид водорода

Целью данного исследования была идентификация генов различных типов ферментов, разрушающих пероксид водорода, в геноме бактерий P. chlororaphis subsp. aurantiaca с последующей оценкой уровней их экспрессии и анализом суммарной активности их белковых продуктов.

Объектами исследования являлись штаммы бактерий P. chlororaphis subsp. aurantiaca, представленных в таблице 1, полученный ранее в работе

Бактерии культивировались в стандартных агаризованных либо жидких средах на основе питательного бульона (ПБ) (SIGMA-ALDRICH, Германия) при температуре 28 °С. Для проведения экспериментов по определению выживаемости бактерий дикого типа и штаммов-продуцентов ночную культуру, объемом 100 мкл (в концентрации 106 КОЕ/мл) засевали в 1 мл питательного бульона и добавляли различные концентрации пероксида водорода. Культивирование проводили при 28 °С без аэрации в течение 2 сут.

Для проведения экспериментов по анализу изменения экспрессии генов ферментов антиоксидантного комплекса 500 мкл ночной культуры (в концентрации 106 КОЕ/мл) засевали в 5 мл питательного бульона, добавляли фиксированные концентрации пероксида водорода. Культивирование проводили при 28 °С без аэрации в течение 2 сут.

Для проведения экспериментов по анализу удельной активности ферментов бактериальные культуры, выращенные на ПБ при 28 °С без аэрации, концентрировали путем центрифугирования (13000 об/мин, 1 мин, при 20 °С) до 2 мл бактериальных клеток, удаляя жидкую питательную среду. 2 мл клеток каждой бактериальной культуры далее использовали для дезинтеграции.

Оптическаую плотность бактериальной культуры в жидкой питательной среде измерялась с помощью спектрофотометра Aligent Cary 60 UV-Vis (Aligent Technologies, Австралия) при длине волны 600 нм.

Геномную ДНК бактерий P. chlororaphis subsp. aurantiaca выделяли с помощью набора GeneJET Genomic DNA Purification Kit К0881 (Thermo Scientific). Поиск генов в геноме P. chlororaphis subsp. aurantiaca проводился в программе SnapGene Viewer.

Разработка праймеров проводилась на основе ранее секвенированного генома P. chlororaphis subsp. aurantiaca В-162

Для определения температуры отжига праймеров, а также анализа возможности образования вторичных структур, была использована программа Олигокалькулятор, размещенная на сайте биологического факультета БГУ, и программа DinaMelt. Последовательность праймеров для анализируемых генов даны в таблице 2. 

Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) проводили с использованием программируемого амплификатора С1000 Touch Thermal Cycler Bio-Rad (США). 

Параметры циклов амплификации для фрамента гена katE были следующими: первичная денатурация – 3 мин при 94 ºС; затем 30 циклов: денатурация – 94 ºС, 1 мин; отжиг – 63 ºС, 30 с; элонгация – 72 ºС, 2 мин 30 с; заключительная достройка – 72 ºС, 5 мин.

Параметры циклов амплификации для фрамента гена katG были следующими: первичная денатурация – 3 мин при 94 ºС; затем 30 циклов: денатурация – 94 ºС, 1 мин; отжиг – 59 ºС, 30 с; элонгация – 72 ºС, 2 мин 30 с; заключительная достройка – 72 ºС, 5 мин.

Параметры циклов амплификации для фрамента гена per были следующими: первичная денатурация – 3 мин при 94 ºС; затем 30 циклов: денатурация – 94 ºС, 1 мин; отжиг – 61 ºС, 30 с; элонгация – 72 ºС, 2 мин 30 с; заключительная достройка – 72 ºС, 5 мин.

Параметры циклов амплификации для фрамента гена gluper были следующими: первичная денатурация – 3 мин при 94 ºС; затем 30 циклов: денатурация – 94 ºС, 1 мин; отжиг – 56 ºС, 30 с; элонгация – 72 ºС, 2 мин 30 с; заключительная достройка – 72 ºС, 5 мин.

Электрофоретический анализ ДНК осуществляли согласно руководству 

Для остановки биосинтетических процессов перед выделением РНК к бактериальной суспензии добавляли 400 мкл смеси фенол:этанол (1:20), после чего производили инкубацию на льду в течение 30 мин. Клетки осаждали 2 мин при 10 000 об/мин и к полученному осадку добавляли ExtractRNA Reagent (Евроген, Россия). Далее выделение РНК проводили по методике, описанной производителем реагента. 

Для удаления остатков тотальной ДНК использовали DNAseI (New England BioLabs, Великобритания). Концентрацию РНК определяли по формуле (1): 

(1)

где А – оптическая плотность раствора при соответствующей длине волны, К –коэффициент пересчета для разных видов нуклеиновых кислот. Для одноцепочечной РНК К=40.

Для оценки чистоты РНК использовали формулу (2): 

(2)

Обратную транскрипцию проводили с помощью обратной транскриптазы ProtoScript II (New England BioLabs, Великобритания). Для реакции использовался 1 мкг РНК. Полученную кДНК в концентрации 10 нг на 20 мкл реакционной смеси использовали для проведения количественной ПЦР в реальном времени. Количественную ПЦР проводили на амплификаторе Bio-Rad CFX96 (Bio-Rad, США) с модулем детекции CFX96TM (Bio-Rad, США) с помощью реагента ArtMixColor (АртБиоТех, Беларусь). Параметры реакции ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ) приведены в таблице 3.

Результаты количественной ПЦР визуализировали с помощью программы Bio-Rad CFX Manager 3.1. Выбор референсных генов для определения экспрессии феназинового оперона производили с помощью программы geNorm.

Анализ результатов ПЦР-РВ Изменение уровней экспрессии рассчитывалось по методу Livak/Schmittgen, согласно формулам (3 – 5).

(3)

(4)

(5)

В качестве референсных генов были выбраны гены «домашнего хозяйства» 16S рРНК и rpoD.

Для получения дезинтегратов бактериальных культур для последующего анализа удельной активности ферментов, клетки из культуральной жидкости осаждали путем центрифугирования (15000 об/мин, 1 мин), отмывали натрий-фосфатным буфером (50 мМ, pH 7,0), концентрировали в соответствующем буфере до 1010-1011кл/мл. Приготовленные концентраты подвергали дезинтегрированию с помощью прибора Bandelin UW 3100 (Германия) (частота 20 кГц, режим: 1,5 сек экспозиция, далее 1,5 сек перерыв, циклично в течение 45 сек), после чего клеточные обломки удаляли центрифугированием в течение 4 мин при 15 000 об/мин. Все процедуры производили на холоде (-4°С – 0°С).

Активность ферментов, разрушающих пероксид водорода, определяли спектрофотометрически по степени разрушения пероксида водорода за единицу времени 

Активность супероксиддисмутазы (СОД) определяли с использованием непрямого спектрофотометрического метода, предложенного в работе 

Определение белка осуществляли по методу Брэдфорд, предложенному в работе 

Погрешность измерения рассчитывалась по формуле 6.

(6)

где m – стандартная ошибка среднего, n – число измерений, S – среднее квадратическое отклонение, вычисляется по формуле 7.

(7)

где  – результаты измерений, M – среднее арифметическое измерений, n – число измерений.

3.1. Определение ингибирующих концентраций пероксида водорода для различных штаммов P. chlororaphis subsp. aurantiaca

Основной задачей начального этапа исследования было обнаружение такой концентрации пероксида водорода для каждого из штаммов, при которой начинается подавление роста бактериальной культуры. Обнаруженную концентрацию планировалось использовать в дальнейших экспериментах по анализу изменения уровней экспрессии генов систем антиоксидантной защиты в клетках продуцентов, что позволило бы определить пределы устойчивости данных систем у бактерий P. chlororaphis subsp. aurantiaca.

Штаммы, устойчивые к различным концентрациям пероксида водорода ранее были получены на кафедре генетики с помощью химического мутагенеза и последующей селекции на устойчивость к пероксиду водорода. Штамм В-162/2 способен расти на полноценных агаризованных питательных средах в присутствии пероксида водорода в концентрации 3,75 мМ, тогда как для штамма В-162/255/15 аналогичный параметр составляет 7,5 мМ. Пероксид водорода был выбран в качестве селектирующего агента, так как он и антибиотики феназинового ряда имеют сходные механизмы антибактериального действия, основанного на индукции окислительного стресса. Известно, что устойчивость мутантных штаммов к тому или иному селективному агенту на агаризованных средах может существенно отличаться от таковой в жидких питательных средах. Поэтому на первом этапе работы были проведены эксперименты по определению выживаемости бактерий дикого типа и штаммов-продуцентов, устойчивых к пероксиду водорода, в присутствии данного селектирующего агента в жидкой питательной среде (см. Материалы и методы). Полученные данные приведены в таблице 4. 

Из данных в таблице видно, что штаммы-продуценты отличаются гораздо более высоким уровнем устойчивости к пероксиду водорода, по сравнению с бактериями дикого типа. Ингибирование роста бактериальной культуры штамма дикого типа начинается уже при концентрации пероксида водорода 3,75 мМ, тогда как продуценты способны выдерживать концентрации данного вещества, почти в 3 раза превышающие таковые для штамма дикого типа. Для штамма В-162/255/15 проанализированные концентрации вообще не являлись ингибирующими. Таким образом, видно, что высокий уровень устойчивости к пероксиду водорода коррелирует с повышением продукции феназинов. Для дальнейших экспериментов по анализу изменения уровней экспрессии генов систем антиоксидантной защиты для штамма дикого типа была выбрана концентрация пероксида водорода 3,5 мМ, для штаммов В-162/2 и В-162/255 – 15 мМ, для штамма В-162/255/15 – 20 мМ.

3.2. Определение удельных активностей супероксиддисмутазы и каталазы

Ранее было показано, что штаммы-продуценты феназиновых соединений, полученные в результате химического мутагенеза и последующей селекции на устойчивость к токсическим аналогам ароматических аминокислот, обладают повышенными уровнями удельной активности ферментов, разрушающих пероксид водорода

В связи с этим интересным представлялось изучить, сохраняется ли подобная тенденция, у штаммов, отобранных по устойчивости к пероксиду водорода. В данном эксперименте культивирование штаммов осуществляли на ПБ, где уровень продукции феназинов относительно невысок (таблица 1), а не на специальной среде ПСА для индукции феназинов. Это позволяло оценить исходный уровень удельной активности ферментов, присущий каждому штамму независимо от наличия в среде феназинов. Полученные данные представлены на рисунке 1.

Рисунок 1 - Удельная активность ферментов, разрушающих пероксид водорода

Примечание: культивирование бактерий осуществляли на питательном бульоне

DOI:10.23670/IRJ.2023.137.59.5

На рисунке 1 видно, что удельная активность данных ферментов у мутантных штаммов действительно существенно возрастает. Так, у штамма В-162/2 она в 4 раза больше аналогичного показателя для штамма дикого типа. У штамма В-162/255/15 увеличение удельной активности составило 2 раза. Однако максимальный уровень удельной активности ферментов, разрушающих пероксид водорода зарегистрирован для штамма В-162/255. Необходимо отметить, что максимальный уровень данного показателя был характерен для этого штамма и при культивировании его на среде ПСА 

На следующем этапе была проведена оценка удельной активности супероксидидисмутазы (СОД) у бактерий дикого типа и мутантных штаммов. Полученные результаты представлены на рисунке 2.

Рисунок 2 - Удельная активность СОД

Примечание: культивирование бактерий осуществляли на питательном рыбном бульоне

DOI:10.23670/IRJ.2023.137.59.6

Как видно из данных, представленных на рисунке выше, наиболее высокая удельная активность данного фермента регистрируется у штамма дикого типа. В отношении мутантных штамов B-162/255, B-162/2 и B-162/255/15 наблюдается тенденция к снижению активности фермента СОД. Похожие результаты были получены ранее в нашей лаборатории при исследовании уровня удельной активности СОД у штаммов, чувствительных к токсическим аналогам ароматических аминокислот на специальной индукционной среде ПСА

[3]

. Имеются литературные данные, что высокие концентрации пероксида водорода ингибируют активность данного фермента

[9]

. В наших исследованиях повышение продукционной активности штаммов оказалось обратно пропорционально удельной активности СОД. Можно констатировать, что данный фермент не играет ключевой роли в защите продуцентов от повышенных концентраций феназинов и ассоциированным с этим окислительным стрессом. Таким образом, именно ферменты, разрушающие пероксид водорода, представляют собой один из ключевых ферментов, задействованных в защите продуцентов от высоких концентраций собственных феназинов. 

Однако данные, полученные на этом этапе исследования, не позволяли сделать вывод о том, по какой причине происходит изменение удельной активности ферментов, обладающих пероксидазной активностью. Одним из возможных путей увеличения удельной активности является активация самого фермента, второй путь подразумевает увеличение экспрессии гена, кодирующего тот или иной фермент. Для выяснения этого вопроса необходимо было проанализировать экспрессию генов, кодирующих пероксид-деградирующие ферменты у изучаемых штаммов. 

3.3. Идентификация генов ферментов деградации пероксида водорода в геноме P. chlororaphis subsp. aurantiaca

Известно, что ферменты, разрушающие пероксид водорода, могут быть представлены в геноме бактерий несколькими вариантами: собственно каталазами различных типов, пероксидазами, глутатионпероксидазами. Все эти ферменты часто объединяются под общим термином «каталазы». 

На данном этапе работы были сконструированы праймеры к ключевым генам, продукты которых принимают участие в защите клеток от пероксида водорода. Согласно данным секвенирования в геноме P. chlororaphis subsp. aurantiaca присутствует несколько генов каталаз, в частности гены katE, katG, а также несколько генов пероксидаз и глутатионпероксидаз. Нами был сконструированы праймеры к 4 генам, анализ уровней экспрессии которых поможет оценить, какие именно ферменты деградации пероксида водорода играют ключевую роль в его разрушении, а, следовательно, защите от повышенных концентраций феназинов, у изучаемых штаммов. Названия генов и последовательности праймеров представлены в таблице 2. На следующем этапе была проведена ПЦР-амплификация с использованием разработанных праймеров, с целью подтверждения присутствия данных генов в геноме P. chlororaphis subsp. aurantiaca. В результате были идентифицированы гены каталазы G (katG), и каталазы Е (katE), пероксидазы (per) и глутатионпероксидазы (gluper). Электрофореграммы, демонстрирующие отдельные результаты ПЦР-скрининга, представлены на рисунке 4. 

3.4. Анализ изменения уровней экспрессии генов, кодирующих ферменты деградации пероксида водорода у штаммов P. chlororaphis subsp. aurantiaca

На следующем этапе работы было проведено исследование уровней экспрессии, обнаруженных в геноме P. chlororaphis subsp. aurantiaca генов, кодирующих ферменты деградации пероксида водорода. Для этого первоначально из культур была выделена тотальная РНК, препарат которой впоследствии был обработан ДНКазой для удаления остатков ДНК. Далее такая очищенная РНК была использована для постановки реакций ОТ-ПЦР и ПЦР в реальном времени. Культуры штаммов (В-162, В-162/2, В-162/255 и В-162/255), из которых выделялась РНК, выращивали в условиях отсутствия пероксида водорода в среде (контроль) и при наличии его субингибирующих концентраций (опыт).

Рисунок 3 - Электрофореграмма продуктов амплификации гена пероксидазы (per) и глутатионпероксидазы (gluper) P. chlororaphis subsp. aurantiaca

Примечание: 1 – маркер молекулярных масс фрагментов ДНК Long Range 10kb DNA, 2 и 3 – ген пероксидазы, 4 и 5 – ген глутатионпероксидазы

DOI:10.23670/IRJ.2023.137.59.7

В качестве референсных генов использовали гены «домашнего хозяйства» rpoD и 16S рРНК. Целью исследования было определить, вызывает ли добавление пероксида водорода в среду культивирования бактериальных штаммов P. chlororaphis subsp. aurantiaca индукцию экспрессии анализируемых генов. Данные, полученные при анализе и обсчете результатов ПРЦ-РВ, представлены в таблице 6. На рисунке 5 дополнительно проиллюстрированы полученные результаты на примере штамма В-162/255 для анализируемого гена katE и генов «домашнего хозяйства» rpoD и 16S рРНК.

Из данных, представленных в таблице видно, что у штамма В-162 регистрируется увеличение экспрессии всех четырех проанализированных генов. Однако наибольшее увеличение экспрессии демонстрирует ген, кодирующий фермент пероксидазу (увеличение в 13,45 раз). Судя по всему, именно этот фермент является основным ферментом защиты у штамма дикого типа. 

Иная картина была зарегистрирована для мутантных штаммов. Так, у штамма В-162/255 при культивировании в питательном рыбном бульоне (ПБ) регистрируется увеличение экспрессии трех генов – katE, per, gluper, причем наибольший рост (в 3 раза) зафиксирован именно для последнего. Видимо, такого уровня экспрессии в сочетании с достаточно высокой исходной удельной активностью СОД на данной питательной среде достаточно для защиты от той концентрации феназинов, которая образуется в этих условиях культивирования. Следует подчеркнуть, что продуктивность этого штамма на ПБ ниже продуктивности штамма дикого типа на этой же среде (см. таблицу 1).

Рисунок 4 - ПЦР-РВ для гена katE штамма B-162/255

А – Электрофореграмма результатов ПЦР в реальном времени;

Б – Регистрация уровня флуоресценции относительно цикла амплификации

Примечание: 1 – маркер молекулярных масс фрагментов ДНК GeneRuler 1 kb DNA, 2-3 – экспрессия гена katE в присутствии пероксида водорода, 4-5 – экспрессия гена katE в отсутствии пероксида водорода, 6 – экспрессия гена 16SRNA в присутствии пероксида водорода, 7 – экспрессия гена 16SRNA в отсутствии пероксида водорода, 8 – экспрессия гена rpoD в присутствии пероксида водорода, 9 – экспрессия гена rpoD в отсутствии пероксида водорода, 10 – отрицательный контроль с праймерами к гену 16SRNA без матрицы, 11-12 – отрицательный контроль с праймерами к гену katE без матрицы, 13 – отрицательный контроль с праймерами к гену rpoD без матрицы

DOI:10.23670/IRJ.2023.137.59.9

У мутантного штамма В-162/2 наблюдается резкое увеличение экспрессии гена gluper (в 22 раза), тогда как некоторые из генов, к примеру, katG, вообще не активны. У штамма В-162/255/15 регистрируется похожая ситуация, однако геном, для которого зафиксировано наибольшее увеличение экспрессии, является katE (5 раз). Стоит отметить, что у этих штаммов на среде ПБ также достаточно невысокий уровень продукции феназинов. 

Таким образом, можно сделать заключение, что при невысоких уровнях продукции феназинов основную защитную роль играют именно СОД и пероксидазы (пероксидаза и глутатионпероксидаза). Причем разные штаммы, по-видимому, активируют разные механизмы защиты. То, что у мутантных штаммов, в отличие от штамма дикого типа, одновременно задействованы не все возможные защитные системы, указывает на то, что эти штаммы испытывают меньший уровень стресса, что может быть обусловлено другими протекторными системами, которые более активны у данных штаммов (уровень глутатиона, глутаредоксина, шаперонов и т.д.).