ВЛИЯНИЕ РАЗЛИЧНЫХ СПОСОБОВ СТЕРИЛИЗАЦИИ ЭКСПЛАНТОВ ГОРОХА ПРИ ВВЕДЕНИИ В КУЛЬТУРУ IN VITRO

В связи с введенными странами ЕЭС против РФ санкциями и в рамках решения Доктрины продовольственной безопасности РФ все большее значение приобретает разработка инновационных направлений в науке. Интенсификация сельского хозяйства определяет необходимость разработки новых эффективных технологий в производстве оздоровленного высококачественного посадочного материала. На современном этапе они неразрывно связаны с применением биотехнологических приемов. Одним из наиболее эффективных является микроклональное размножение, при котором реальные коэффициенты размножения в сотни и даже тысячи раз выше, чем при любом из традиционных приемов.

Горох посевной – высокобелковая культура, богатая медленно усвояемыми углеводами, пищевыми волокнами, витаминами, микроэлементами, в том числе железом, цинком, кальцием

В России посевные площади и валовой сбор гороха к 2021 г. достигли 1444,9 тыс. га и 2700 тыс. тонн.

В процессе селекции отбор и сохранение ценных исходных и полученных форм затрудняется. Нередко гибель зародышей возникает на ранних стадиях развития. Поэтому трудности получения необходимых признаков затягивают всю селекционную работу. В связи с этим, необходимость получения высокопродуктивных, устойчивых к биотическим и абиотическим факторам сортов и гибридов также требует использования современных методов биотехнологии, ускоряющих селекционный процесс и повышающих его эффективность

Биотехнологические методы дают возможность получать и сохранять генетически однородный материал и проводить направленные отборы. По литературным данным ранее разработанные методики микроразмножения гороха очень громоздки и трудоемки

В связи с этим является актуальной потребность в разработке и совершенствовании различных методов биотехнологии, позволяющих создавать новый и сохранять ценный селекционный материал в культуре изолированных органов и тканей такой важной культуры, как горох

Успех введения в культуру in vitro растительного материала во многом определяется качеством стерилизации. Выбор стерилизующего агента зависит от особенностей экспланта. Чем нежнее растительная ткань, тем меньше должна быть концентрация стерилизующего агента, чтобы сохранить её жизнеспособность. Часто внутреннее заражение исходных эксплантов бывает намного сильнее, чем поверхностное. Чтобы предотвратить это заражение, растительный материал предварительно обрабатывают фунгицидами и антибиотиками против грибной и бактериальной инфекций

Вид стерилизующего агента, его концентрацию и время действия, зависящие от особенностей тканей исходных растений, необходимо подобрать таким образом, чтобы убить микроорганизмы и не повредить ткани экспланта.

Еще одним важным условием является то, что стерилизующее вещество должно легко удаляться из ткани промывкой дистиллированной водой или разлагаться. Иначе происходит отравление тканей, что негативно влияет на дальнейший рост культуры. Чаще всего для поверхностной стерилизации растительных тканей используют соединения, содержащие активный хлор (гипохлорит натрия, гипохлорит кальция, хлорамин) и другие

Исследования по подбору стерилизующего агента немногочисленны, что является актуальным и своевременным.

Поэтому цель наших исследований – оптимизировать процесс стерилизации эксплантов гороха при введении в культуру in vitro.

В соответствии с этим были поставлены следующие задачи:

1. Подобрать стерилизующий агент, оказывающий наиболее эффективное обеззараживающее действие на вводимый эксплант;

2. Определить оптимальную концентрацию и экспозицию стерилизующего агента;

Исследования проводили в 2023 году в лаборатории автоматизации микроклонального размножения Сибирского федерального научного центра агробиотехнологий РАН.

Объект исследований – среднеспелый сорт гороха Холик. Среднеустойчив к растрескиванию и осыпанию. Урожайность зерна составляет 2,2–3,0 т/га

Для эксперимента в качестве экспланта брали стебель с листом. Работы по стерилизации проводили согласно схеме опыта (табл. 1).

Культивирование эксплантов осуществляли на питательной среде Мурасиге и Скуга с концентрацией 6-БАП – 0,5 мг/л; ИУК – 0,1 мг/л. приготовленной по общепринятой методике

Температурный режим +23-25 0С, с 16-часовым фотопериодом.

За контроль брали дистиллированную автоклавированную воду с антибиотиком цефотаксим и без него. Белизну разбавляли дистиллированной автоклавированной водой в определенной пропорции согласно схеме эксперимента.

Стерилизацию проводили по следующему алгоритму:

- В случае с одним стерилизующим агентом эксплант погружали в стерилизующий агент, выдерживали время экспозиции, далее его переносили в емкость с дистиллированной автоклавированной водой, промывали, помещали в емкость с раствором антибиотика цефотаксим в концентрации 5%.

- В случае с двумя стерилизующими агентами эксплант погружали в первый стерилизующий агент, выдерживали время экспозиции, далее его переносили в емкость с дистиллированной автоклавированной водой, промывали, погружали в емкость со вторым стерилизующим агентом, выдерживали время экспозиции, далее снова промывали дистиллированной автоклавированной водой, помещали в емкость с раствором антибиотика цефотаксим в концентрации 5%.

Количественный учет эксплантов проводили в день их пересадки в пробирки (30 августа). Визуальные наблюдения за эксплантами – в течении всего периода эксперимента. Высоту растений подсчитывали на 7 и 14-е сутки.

Всего изучалось 16 вариантов, повторность опыта – 2-кратная (по 2 пробирки каждого варианта), количество эксплантов в каждой пробирке – 2.

Статистическую обработку данных осуществляли с помощью пакета прикладных программ Snedekor

В результате исследований по влиянию способов стерилизации оптимальным вариантом оказалось применение двух стерилизующих агентов Белизна (1:4) +спирт (95%), с экспозицией 15 минут. Количество развитых стерильных эксплантов было наибольшим по отношению к варианту с дистиллированной водой. Контроль, несмотря на выход всех развитых эксплантов, не дает возможности в получении здоровых, из-за отсутствия активного барьера против инфекции, что в дальнейшем может негативно отразиться на росте и развитии растений. Более высокие концентрации белизны (1:3) не способствовали получению большего количества развитых эксплантов (табл. 2, рис. 1).

Установлено, что контроль без антибиотика дал наибольшее количество развитых эксплантов, при этом среди них два зеленых, в сравнении с контролем, где применялся цефотаксим. Вероятно, 5% концентрация привела к ингибированию роста эксплантов.

Рисунок 1 - Общий вид культивируемых эксплантов на 7-е сутки

DOI:10.23670/IRJ.2023.137.56.3

Следует отметить, что использование спирта в качестве второго стерилизующего агента является дополнительной гарантией в получении здоровых эксплантов, свободных от инфекции. О чем свидетельствует корреляционный анализ. По мере удлинения экспозиции и добавления второго стерилизующего агента отмечается сильная обратная зависимость (r = - 0,92) между зелеными и погибшими эксплантами, а также сильная прямая зависимость (r = 0,79) между зелеными и развитыми эксплантами.

Наибольший недельный и среднесуточный прирост отмечен на варианте с белизной в концентрации 1:4 совместно со спиртом с экспозицией 15 минут, и составил 2,8 см и 0,39 см/сутки соответственно (табл. 3). 

Повышение концентрации стерилизующего агента независимо от его экспозиции привело к снижению интенсивности роста до 0,07 см/сутки. Визуально эти экспланты имели желтую окраску нижних листьев, а в некоторых случаях происходило их увядание.

1. Оптимальным вариантом является сочетание двух стерилизующих агентов. Концентрация белизны (1:4) и спирта (95%) с экспозицией погружения 15 минут способствует наибольшему эффекту от стерилизации и получению максимального количества развитых эксплантов.

2. По мере удлинения экспозиции и добавления второго стерилизующего агента отмечается сильная обратная зависимость (r = - 0,92) между зелеными и погибшими эксплантами, а также сильная прямая зависимость (r = 0,79) между зелеными и развитыми эксплантами.

3. Интенсивность роста эксплантов была наибольшей и составила 0,39 см/сутки, что в 6 раз выше, чем на вариантах с высокими концентрациями стерилизующего агента.

4. Более высокие концентрации белизны (1:3) не способствовали получению большего количества развитых эксплантов.