USE OF PCR GENOTYPING ON A SAMPLE OF TURKEYS FROM THE CREATED MEDIUM CROSS

Циркулирование возбудителей бактериальных инфекций во внешней среде приводит к периодическим вспышкам заболеваний

В настоящее время постоянно обнаруживаются резистентные бактерии к новейшим препаратам. Проблема антибиотикорезистентности микроорганизмов наиболее актуальна в отрасли птицеводства, в нашем случае для индейководства. Снижение актуальности этой проблемы достигается как контролируемым применением антибиотиков, так и использованием генотипирования в профилактических целях

Цель исследований: целью научно-исследовательской работы являлось определение антибиотикорезистентности патогенной и условно-патогенной микрофлоры, выделяемой у индеек создаваемого среднего кросса СГЦ «СКЗОСП» для составления схем ветпрофилактики и биозащиты, подбор условий для выявления методом RAPD-PCR генетических вариантов патогенных штаммов E. coli – актуального патогена птиц промышленных пород. 

Исследования были проведены на производственной базе СГЦ «СКЗОСП» – филиала ФНЦ «ВНИТИП». В соответствии с государственным заданием в СГЦ проводится работа по созданию нового среднего кросса индеек. После завершения всех регистрационных процедур кросс получит свое официальное название. Совместно с исполнителями темы от ВНИВИП – филиала ФНЦ «ВНИТИП» было проведено клиническое обследование всего поголовья индеек, проанализированы меры биобезопасности, исследована действующая схема профилактических и противоэпизоотических мероприятий, проведено вскрытие павшей индейки, отобран патологический материал для дальнейшего бактериологического и ПЦР-анализа. Бактерии выделяли также из 20 клинически здоровых индеек для молекулярно-генетического исследования. Данные работы проводились в лаборатории молекулярной генетики ВНИИГРЖ (лаборатория имеет статус «Лаборатория молекулярно-генетической экспертизы», который был выдан в соответствии с приказом № 605 МСХ РФ 29 декабря 2018 г. со сроком действия на 5 лет). Биопробы из внутренних органов индеек помещены в транспортную среду Кэри-Блэйра. После транспортировки все пробы пересеяны на питательную среду для культивирования аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов: мясопептонный бульон для дальнейшего термостатированния при 37оС. Через 24 часа сделаны пересевы на дифференциально-диагностические среды – XLD-агар, агар Эндо, энтерококк агар, желточно-солевой агар, мясопептонный агар. Выделенные на дифференциально-диагностических средах культуры в дальнейшем исследованы на определение чувствительности к антибактериальным препаратам диско-диффузионным методом на среде Мюллера-Хинтона. В результате бактериологического исследования проб внутренних органов и проб смывов с клоаки были выделены 22 культуры E.coli, которые служили объектом для ПЦР-генотипирования. Из них 20 изолятов представляли собой культуры, выращенные из мазков клоаки индеек. Помимо этих изолятов в анализ были включены также бактериальные культуры, полученные от павшей индейки под номерами 21 и 22.

Объектом исследования по генотипированию методом RAPD-PCR являлись изоляты бактерий Escherichia coli, выделенные из органов павшей индейки, а также из здоровых особей. Механизм детекции различий методом ПЦР заключается в разных местах связывания праймеров у разных видов и штаммов, что приводит к амплификации фрагментов ДНК разной длины.

Условия ПЦР для праймеров ERIC и М13: 95оС – 3 минуты, потом 45 циклов: 95оС – 15 секунд, 37оС – 15 секунд, 72оС – 60 секунд, в конце 72оС – 3 минуты. После завершения ПЦР образцы переносятся в лунки 1,5% агарозного геля и проводится электрофорез в течении 3-х часов при напряжении 100 вольт (примерно 5В/см). В гель предварительно вносится бромид этидия для визуализации свечения полос ДНК. В качестве маркера длин фрагментов ДНК использован GeneRuler (Thermo Fischer™) и ДНК фага λ, обработанная рестриктазой HindIII. Визуализация результатов проводилась с помощью окраски ДНК бромидом этидия на стадии перенесения в лунки геля и гель-документации под УФ-светом в трансиллюминаторе ECX-F20.M Vilber Lourmat.

В 2023 году проведено выделение на дифференциально-диагностических средах культур, которые в дальнейшем подвергались культурально-биохимическим исследованиям и определению чувствительности к антибактериальным препаратам диско-диффузионным методом на среде Мюллера-Хинтона (Табл. 1).

В результате бактериологического исследования проб внутренних органов и проб смывов с клоаки были выделены 22 культуры E.coli, которые служили объектом ПЦР-генотипирования. Из них 20 изолятов представляли собой культуры, выращенные из мазков клоаки индеек. Помимо этих изолятов в анализ были включены также бактериальные культуры, полученные от павшей индейки под номерами 21 и 22.

В результате проведения ПЦР-генотипирования c использованием праймеров ERIC получены генетические профили изучаемых бактерий (Рис. 1) с формированием трех групп. К первой группе относятся изоляты под номерами 9, 10 и 11, второй – 7 и 16, третьей – 2, 4, 5 и 17. У отдельных изолятов праймеры ERIC не привели к четкой амплификации ДНК: 1, 4, 8, 13. Изоляты 21 и 22 были выделены из почки и селезенки павшей особи, видно, что между генетическими профилями есть различия. Данное наблюдение свидетельствует о возможности циркулирования разных штаммов в одной особи (в разных органах). В связи с тем, что праймеры ERIC выявляют малое число фрагментов ДНК в геномах E.coli, не удивительно, что у некоторых штаммов амплификат отсутствовал. Для достижения большей дискриминационной способности необходимо проведение генотипирования с большим числом праймеров и комбинирования этих результатов.

Рисунок 1 - Результаты генотипирования 22 изолятов E.coli методом ПЦР с парой праймеров ERIC:

1-17 – смыв из клоаки индеек (выделение изолятов 07.04.23); 18-20 – смыв из клоаки индеек (выделение изолятов 21.04.23); 21 – изолят из почки павшей индейки (выделение изолята 07.04.23); 22 – изолят из селезенки павшей индейки (выделение изолята 07.04.23)

DOI:10.23670/IRJ.2023.137.151.2

Далее было проведено генотипирование этих же изолятов с помощью универсального праймера М13. Результаты генотипирования свидетельствуют о высоком генетическом разнообразии в изучаемой группе изолятов. Бактерии выращивались из мазков клоаки, т.е. имели эндогенную природу, что, возможно, объясняет их разнообразие. Тем не менее в отдельных случаях генетические профили совпадали, что говорит о существовании идентичных штаммов в кишечнике разных особей.

Рисунок 2 - Результат генотипирования 21 изолятов E. coli с универсальным праймером М13: 

1-19 – смывы из клоак здоровых индеек; дорожка 20 – изолят из почки павшей индейки; дорожка 21 – изолят из селезёнки заболевшей индейки

DOI:10.23670/IRJ.2023.137.151.3

Анализ генетических профилей показал хорошую воспроизводимость результатов, полученных с праймерами ERIC и M13. Таким образом, в случае недостаточной дискриминации штаммов при ПЦР-генотипировании с праймерами ERIC дополнительно можно провести амплификацию с праймером М13.

В 2023 году в СГЦ «СКЗОСП» – филиале ФНЦ «ВНИТИП» были продолжены исследования бактериальных изолятов от индеек создаваемого среднего кросса. Научная новизна работы заключается в валидации RAPD-PCR-метода генотипирования с применением праймеров ERIC и М13 на изолятах, полученных от индеек. Показано существенное генетическое разнообразие изолятов данной бактерии и хорошая воспроизводимость результатов при генотипировании с разными праймерами (ERIC и M13). Данный метод по генотипированию изолятов E. coli является одним из самых быстрых и не дорогих подходов к идентификации бактериальных штаммов. Результатом исследования используются при составлении схем ветеринарно-профилактических и противоэпизоотических мероприятий для поголовья индеек.