ПОЛИМОРФИЗМ TOLL-ПОДОБНЫХ РЕЦЕПТОРОВ – TLR4 (Asp299Gly) и TLR6 (Ser249Pro) У ПАЦИЕНТОВ С ТУБЕРКУЛЕЗОМ ЛЕГКИХ

Туберкулез (ТБ) – относится к категории особо опасных инфекционных заболеваний и уносит ежедневно жизни более 4500 тысяч человек по всему земному шару. Наиболее подвержены заражению лица, испытывающие социально-экономические трудности, работающие и проживающие в условиях высокого риска инфицирования, малоимущие и обездоленные граждане. На территории Российской Федерации в последние несколько лет отмечается тенденция к снижению уровня заболеваемости, распространенности, смертности и инвалидизации населения от туберкулеза

Врожденный иммунитет является первой линией защиты восприимчивого организма от инфекционных агентов

Одним из наиболее значимых представителей семейства PRRs считаются Toll – подобные рецепторы, функции и экспрессия которых очень широко изучается как в норме, так и в патологии

Толл – подобные рецепторы (англ. Toll – like receptor, TLR) – класс клеточных рецепторов с одним трансмембранным компонентом, который распознает составные части бактерий и активирует клеточный иммунитет, в итоге эти рецепторы выполняют главную роль в первичном иммунном ответе

В настоящее время идентифицированы 13 представителей семейства TLR, среди которых TLR 1-9 – выявляются у мышей и человека, TLR 10 - только у человека, TLR 11, 12, 13, только у мышей

Учитывая вышесказанное, в настоящее время нам кажутся перспективными исследования о функционировании системы Toll – подобных рецепторов, а так же влияние полиморфизмов генов человека на этиопатогенез туберкулеза.

Цель исследования: изучить влияние полиморфизма генов TLR4 (Asp299Gly) и TLR6 (Ser249Pro) на течение туберкулезного процесса в легких. В работе приведены данные результатов комплексного изучения 120 пациентов с установленным диагнозом «Туберкулез органов дыхания» состоящих на учете у фтизиатра в период 2014-2015 гг.

Критериями включения явились наличие подтвержденного диагноза туберкулеза органов дыхания. Критериями исключения послужили: больные с неустановленным диагнозом туберкулеза, с тяжелой коморбидной патологией (сахарный диабет обоих типов, опухоли легких).

Контрольную группу составили 30 исследуемых в возрасте 38,5+3,5 лет никогда не болевших туберкулезом и не состоящих на учете в фтизиопульмонологическом центре. Все исследуемые – жители Забайкалья, сопоставимы по возрасту и полу.

Всеми участниками подписано информированное согласие на включение в исследование № 69/2014 от 24 декабря 2014 года, которое было одобрено на заседании этического комитета ФГБОУ ВО «Читинская государственная медицинская академия».

Молекулярно-генетическое исследование проведено в НИИ Молекулярной медицины ЧГМА. В качестве биологического материала для исследования полиморфных маркеров использовали цельную кровь. Определение полиморфизма генов TLR4 Asp299Gly (rs4986790, A896G), TLR6 Ser249Pro (rs5743794, C745T) осуществлялось методом ПЦР с использованием праймеров ООО «Литех» (г. Москва). Анализу подвергалась геномная ДНК, выделенная из лейкоцитов цельной крови c помощью реагента «ДНК-экспресс-кровь», затем проводилась реакция амплификации с двумя парами аллель-специфичных праймеров.

Этап: цельная кровь с ЭДТА (антикоагулянт ЭДТА K3 / ЭДТА K2) центрифугировалась, после удалялась плазма, форменные элементы замораживались при -20°С. Затем содержимое пробирки размораживалось при комнатной температуре, и добавлялся реактив «ДНК-экспресс-кровь» равный по объему количеству форменных элементов в пробирке. Содержимое пробирки тщательно перемешивалось в течение 10 сек, и пробирка устанавливалась в предварительно прогретый до 98°С термостат на 10 мин. Затем центрифугировалась со скоростью 8000-12000 об/мин в течение 15 мин. Полученный супернатант использовали в качестве образца ДНК.

1 этап: Из компонентов комплекта готовили рабочие смеси с реакционной смесью норма и патология. После приготовления смеси разносили по 20 мкл в соответствующие пробирки и добавляли по 5 мкл супернатанта. Содержимое пробирок центрифугировали со скоростью 1500­3000 об/мин 3-5 сек и устанавливали в подогретый до +94°С программируемый термостат.

2 этап: Разделение продуктов амплификации методом горизонтального электрофореза.

3 этап: Разделение продуктов амплификации методом горизонтального электрофореза.

4 этап: Анализ результатов. Фрагменты анализируемой ДНК проявляются в виде светящихся полос (рис. 1).

Результаты анализа позволили дать три типа заключений: нормальная гомозигота, гетерозигота, мутантная гомозигота.

Распределение генотипов по исследуемым полиморфным локусам сравнивали на соответствие равновесию Харди - Вайнберга. Сравнение частот распределения генотипов в группах исследования проводили с помощью критерия χ2 (Пирсона) с поправкой Йейтса на непрерывность с использованием 4-польной таблицы сопряженности; если ожидаемых явлений в одной из ячеек было меньше 5, применяли точный критерий Фишера. Для оценки ассоциации изучаемых полиморфных вариантов генов с риском развития туберкулеза рассчитывали отношение шансов (Odds Ratio – OR) с доверительным интервалом 95%, причем OR=1 трактовали как «отсутствие ассоциаций»; OR>1 – как «положительную ассоциацию», OR<1 – как «отрицательную ассоциацию» генотипа с туберкулезом. Математическую обработку полученных результатов проводили методами непараметрической статистики на персональном компьютере при помощи Statistica 10 и с использованием online-калькулятора (http://gen-exp.ru/calculatoror.php).

Рисунок 1 - Электрофореграммы продуктов амплификации (позитив и негатив): 

1 - нормальная гомозигота; 2 - гетерозигота; 3 - мутантная гомозигота

DOI:10.23670/IRJ.2023.137.140.1

В процессе исследования обнаружены все искомые аллели в гомо- и гетерозиготном состоянии. Распределение SNP (single nucleotide polymorphism) генов в исследованных группах соответствовало закону Харди-Вайнберга. Полиморфизм гена TLR 4 (Asp299Gly) по гомозиготному варианту генотипа Asp/Asp, в группе больных туберкулезом был в 20,9 раза ниже по сравнению с его частотой в контроле. Однако, носители гетерозиготного Asp/Gly исследуемого гена в группе здоровых реципиентов встречались на 18,4% чаще, чем обладатели этого же генотипа среди больных (табл.1).

Ген TLR4(CD284) расположен на хромосоме 9q32-33, экспрессируется как внутриклеточно, так и экстрацеллюлярно, запускает иммунный ответ по MyD88-независимому пути. Полиморфный маркер Asp299Gly гена TLR4представляет собой однонуклеотидную замену А → G в положении +896 в экзоне 3, приводящую к аминокислотной замене аспарагиновой кислоты на глицин в положении 299 полипептидной цепи во внеклеточном домене рецептора. Выявлено, что полиморфизм Asp299Gly гена TLR4 тесно связан с развитием гематогенного остеомиелита и системного кандидоза, бактериальных инфекций, передающихся половым путем, респираторно-синцитиальной инфекции у детей младшего возраста и новорожденных, 26 сепсиса, вызванного грамм-отрицательными бактериями, атопической патологии

При анализе распределения частоты генотипов полиморфизма гена TLR 6 (Ser249Pro) у пациентов с туберкулезом выявлено снижение количества гетерозиготного генотипа Ser/Pro (в 4,2 раза) и увеличение числа носителей гомозиготного генотипа Ser/Ser (в 21,7 раза) по сравнению с таковыми в контрольной группе.

Гомозиготный вариант генотипа по мутантному полиморфизму Pro/Pro гена TLR 6 обнаруживался у 15 больных туберкулезом (12,5% исследуемых) соответственно (табл. 2).

Полученные данные согласуются с расчетами отношения шансов, которое свидетельствует в пользу того, что носительство гетерозиготного варианта Asp/Gly гена TLR 4 (Asp299Gly) (OR=9,942 [95% CI: 1,205 – 70,851]) и гомозиготного генотипа Ser/Ser полиморфизма гена TLR 6 (Ser249Pro)(OR=2,494 [95% CI: 1,056 – 5,889]) могут быть ассоциированы с развитием туберкулеза органов дыхания и рассматриваются как факторы риска развития заболевания (табл. 1).

Ген TLR6(CD286) локализован в хромосоме 4р13, по данным исследователей из Кореи с ишемическим инсультом ассоциированы некоторые SNP в гене TLR6 (Ser249Pro) в корейской нации, так же предполагают, что они влияют на тяжесть инсульта

По результатам расчета критериев Крамера (V) и критерия Чупрова (K) выявлено, что наличие у жителей Забайкальского края гомозиготного генотипа Asp/Asp гена TLR 4 (Asp299Gly)(φ=0,2), полиморфизма Ser/Ser гена TLR 6 (Ser249Pro) (φ=0,1) и гетерозиготного Asp/Gly гена TLR 4 (Asp299Gly) (φ=0,3) и мутантного полиморфизма Pro/Pro гена TLR6 (Ser249Pro)связано с риском развития туберкулеза, так как является фактором предрасположенности к болезни (табл. 3).

В настоящем исследовании у большинства пациентов с туберкулезом нами выявлено носительство ассоциированных с развитием заболевания полиморфизмов генов Toll-подобных рецепторов по «высокопродуцирующему» аллелю генотипа Asp/Asp гена TLR 4 (Asp299Gly), Ser/Ser гена TLR 6 (Ser249Pro) и гетерозиготного Asp/Gly гена TLR 4 (Asp299Gly), а так же мутантного полиморфизма Pro/Pro гена TLR 6 (Ser249Pro).

Результаты исследования показывают, что индивидуальное носительство различных вариантов полиморфизмов генов TLR оказывает влияние на характер течения патологического процесса в легочной ткани, что в будущем, вероятно, позволит прогнозировать тяжесть течения и исход заболевания.