ИССЛЕДОВАНИЕ ЭМОЦИОНАЛЬНОГО СОСТОЯНИЯ ПОТОМСТВА КРЫС, ПОЛУЧАВШИХ ВОДНЫЕ РАСТИТЕЛЬНЫЕ ЭКСТРАКТЫ

Влияние биологически активных соединений на функциональное состояние центральной нервной системы и эмоциональную составляющую крыс можно оценить с помощью поведенческих методов, которые основаны на изучении исследовательского поведения животных в новом для них окружении [1], [3], [4], [5]. Одним из таких методов является исследование поведения животного в приподнятом крестообразном лабиринте (ПКЛ), имеющем открытые и закрытые рукава и тест «отчаяния» по Porsolt [6], [7], [8].

Поведение живых организмов строится на основе удовлетворения ведущих потребностей и оценки достигнутых результатов. Индивидуальное поведение животных включает разнообразные поведенческие акты, обеспечивающие выживание отдельной особи [9], [10], [11]. К формам индивидуального поведения относятся, например, локомоция, поиск убежища, избегание хищников, груминг, исследовательская активность. Поведение конкретного животного является результатом взаимодействия генетических факторов и приобретенного опыта [11], [12], [13], [14].

Считается, что в приподнятом крестообразном лабиринте у грызунов определяется исследовательское поведение, которое отражает стремление к ознакомлению с новой обстановкой в сочетании с осторожностью и включает когнитивный компонент в виде ориентации в пространстве [6], [15].

Методика поведенческого отчаяния (беспомощности) по методу Порсолта является базисной моделью оценки влияния биологически активных соединений – антидепрессантов [16]. Суть метода в том, что животные, попадая в воду, начинают проявлять бурную двигательную активность, направленную на поиск выхода из неприятной ситуации. Затем животные оставляют попытки выбраться из сосуда и зависают в воде в характерной позе, оставаясь полностью неподвижными или совершая незначительные движения, которые необходимы для поддержания морды над поверхностью воды. Данный тест позволяет установить выраженность депрессивного состояния у животного по длительности стадии иммобилизации [16], [17], [18].

Различные биологически активные вещества способны модулировать психотропную активность животного, которая может проявляться седацией или психостимуляцией (по уменьшению или увеличению двигательной и исследовательской активности), транквилизирующим или анксиолитическим эффектом (по увеличению времени в открытых рукавах ПКЛ и латентного периода до начала исследования животными рукавов ПКЛ), а также ноотропным эффектом (показатели поведения патрулирования рукавов в ПКЛ, динамика двигательной и исследовательской активности).

В связи с этим, целью нашего исследование явилось изучение эмоционального состояния потомства крыс, получавших водные растительные экстракты.

Для реализации поставленной цели предстояло решить следующие задачи: получить потомство от крыс, которым в качестве дополнительной нагрузки ежедневно в течение 30 суток вводили водные экстракты центеллы азиатской, гинкго билоба, элеутерококка и смесь водных экстрактов центеллы азиатской и гинкго билоба и провести анализ влияния этих субстанций на эмоциональное состояние потомства.

Экспериментальные исследования проводили в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» и с соблюдением принципов гуманности, изложенных в директивах Европейского сообщества (86/609/ЕС). Изучение эмоционального состояния потомства крыс, получавших водные растительные экстракты производили на 3-х месячных животных, полученных в эксперименте от самцов (20 штук) и самок (50 штук), которые в течение 30 суток получали водные растительные экстракты в дозе 30 мг/100 г массы тела животного, объемом 1 мл. В эксперименте было 5 групп животных и в каждой группе было 10 самок и 4 самца: 1 группа – контроль, крысы получали ежедневно внутрижелудочно дистиллированную воду, объемом 1 мл; 2 группа – животные получали водный экстракт центеллы азиатской; 3 группа – водный экстракт гинкго билоба, 4 группа – водный экстракт элеутерококка, 5 группа – смесь водных экстрактов центеллы азиатской и гинкго билоба. Водные экстракты центеллы азиатской и гинкго билоба приобретали в ООО «КоролёвФарм». Водный экстракт элеутерококка готовили на кафедре фармацевтической технологии из стандартизированного сырья. Для получения самок с датированным сроком беременности использовали стандартные методы.

Исследование проводили в приподнятом крестообразном лабиринте, который позволяет оценить степень тревожности, возникающую в результате стресса, вызванного высотой и необычностью ситуации – помещением на открытое освещенное пространство. Тестирование производили в течение 5 мин и регистрировали следующие показатели: время пребывания в закрытых и открытых рукавах, число заходов в открытые и закрытые рукава, количество стоек, свешиваний с рукава, дефекаций [19], [20], [21], [22].

Уровень депрессии оценивался в тесте «отчаяния» по Porsolt, суть которого состоит в том, что после помещения в стеклянный цилиндр диаметром 20 см и высотой 40 см, на 1/3 заполненный водой с температурой 25±1 °С, животное активно пытается выбраться из воды, плавая и совершая прыжки вверх, нырки под воду в поисках выхода, затем замирает в воде в характерной позе (иммобилизация). Выраженность депрессии оценивается по латентному времени до первой иммобилизации крысы, по длительности времени иммобилизации, по количеству попыток выбраться из воды, оцененных в опыте течение 5 минут [19], [20], [21], [22]. Также проводили статистическую обработку полученных результатов.

Исследование степени тревожности производили в приподнятом крестообразном лабиринте, который позволяет оценить степень тревожности, возникающую в результате стресса, вызванного высотой и необычностью ситуации – помещением на открытое освещенное пространство. Результаты эксперимента представлены в таблице 1.

При оценке количества свешиваний крыс с приподнятого крестообразного лабиринта установлено, что потомство крыс, получавших экстракт центеллы азиатской демонстрировало большее на 28,9 % (Manna-Whitney: U=90,500, Z = 2,856952 при р=0,000113) свешиваний по сравнению с контролем, потомство крыс, получавших экстракт гинкго билоба – большее на 17.5 % (Manna-Whitney: U=215,500, Z = 3,445741 при р=0,004115)  свешиваний, а потомство крыс, получавших экстракт элеутерококка характеризовалось примерно одинаковым количеством свешиваний с интактными крысами. Потомство крыс, получавших смесь растительных экстрактов демонстрировало большее на 71,1 % (Manna-Whitney: U=144,000, Z = 2,856584 при р=0,000000) свешиваний по сравнению с контролем.

При оценка количества посещений открытых рукавов потомством крыс, получавших водные растительные экстракты, было установлено, что крысята экспериментальных группы это делали чаще, чем крысята контрольной группы: потомство крыс, получавших экстракт центеллы азиатской посещало открытые рукава чаще, чем интактные крысы на 46,7 % (Manna-Whitney: U=177,500, Z = 4,455741 при р=0,002114), потомство крыс, получавших экстракт гинкго билоба – чаще на 68,3 % (Manna-Whitney: U=86,00000, Z = 5,374139, при р=0,00000), потомство крыс, получавших экстракт элеутерококка – чаще на 7,19, а потомство крыс, получавших смесь растительных экстрактов – чаще на 123,9 % (Manna-Whitney: U=15,50000, Z = 6,415441, при р=0,00000).

Оценка количества посещений закрытых рукавов потомством крыс, получавших водные растительные экстракты, выявила аналогичную открытым рукавам тенденцию: крысята экспериментальных группы это делали в основном чаще, чем контроль: потомство крыс, получавших экстракт центеллы азиатской посещало закрытые рукава чаще, чем интактные крысы на 34,4 % (Manna-Whitney: U=125,000, Z = 2,844741 при р=0,002398), потомство крыс, получавших экстракт гинкго билоба – чаще на 51,2 % (Manna-Whitney: U=167,400, Z = 3,356696 при р=0,00000), потомство крыс, получавших экстракт элеутерококка – на уровне контрольной группы, а потомство крыс, получавших смесь растительных экстрактов – чаще на 72,0 % (Manna-Whitney: U=193,500, Z = 4,255152 при р=0,000015).

Потомство крыс, получавших водные растительные экстракты, проводили больше времени в открытых рукавах приподнятого крестообразного лабиринта, чем крысята контрольной группы: потомство крыс, получавших экстракт центеллы азиатской – больше на 22,3 % (Manna-Whitney: U=99,000, Z = 2,988787 при р=0,000315) времени, потомство крыс, получавших экстракт гинкго билоба – больше на 28,7 % (Manna-Whitney: U=132,000, Z = 4,444784 при р=0,003665), потомство крыс, получавших экстракт элеутерококка – больше на 12,7% (Manna-Whitney: U=128,9000, Z = 4,588958 при р=0,003774), а потомство крыс, получавших смесь растительных экстрактов – больше на 34,2 % (Manna-Whitney: U=197,000, Z = 5,488747 при р=0,000000) времени.

Потомство крыс, получавших водные растительные экстракты, проводили меньше времени в закрытых рукавах приподнятого крестообразного лабиринта, чем крысята контрольной группы: потомство крыс, получавших экстракт центеллы азиатской – меньше на 19,9 % (Manna-Whitney: U=96,0000, Z = 2,987747, при р=0,000000) времени, потомство крыс, получавших экстракт гинкго билоба – меньше на 16,0 % (Manna-Whitney: U=157,80000, Z = 2,587741, при р=0,004668), потомство крыс, получавших экстракт элеутерококка – примерно, как интактные крысята, а потомство крыс, получавших смесь растительных экстрактов – меньше на 35,9 % (Manna-Whitney: U=166,6000, Z = 3,358858, при р=0,003447) времени.

Потомство крыс, получавших водные растительные экстракты, кроме экстракта элеутерококка, проводили меньше времени в центре приподнятого крестообразного лабиринта, чем крысята контрольной группы: потомство крыс, получавших экстракт центеллы азиатской – меньше на 12,4 % (Manna-Whitney: U=124,5000, Z = 3,477541, при р=0,004698) времени, потомство крыс, получавших экстракт гинкго билоба – меньше на 9,5 % (Manna-Whitney: U=147,8000, Z = 3,699828, при р=0,000115), потомство крыс, получавших экстракт элеутерококка – больше на 6,2 %, чем интактные крысята, а потомство крыс, получавших смесь растительных экстрактов – меньше на 29,5 % (Manna-Whitney: U=156,3000, Z = 5,488726, при р=0,000128) времени.

Потомство крыс, получавших водный растительный экстракт центеллы азиатской и смесь водных экстрактов центеллы азиатской и гингко билоба не совершало груминг в открытых рукавах приподнятого крестообразного лабиринта, а потомство крыс, получавших водный экстракт гинкго билоба и элеутерококка совершало груминг, но его длительность по времени была меньше, чем в контроле на 66,5 % (Manna-Whitney: U=115,5000, Z = 3,654414, при р=0,002111) и 28,7 % (Manna-Whitney: U=177,5000, Z = 3,785874, при р=0,002114) соответственно.

В закрытых рукавах приподнятого крестообразного лабиринта крысята всех групп совершали груминг, но потомство крыс, получавших водные растительные экстракты, кроме экстракта элеутерококка, характеризовались меньшим временем груминга, чем крысята контрольной группы: потомство крыс, получавших экстракт центеллы азиатской – меньше на 36,4 % (Manna-Whitney: U=156,2000, Z = 4,233531, при р=0,000111) времени, потомство крыс, получавших экстракт гинкго билоба – меньше на 24,6 % (Manna-Whitney: U=92,0000, Z = 5,632212, при р=0,000000), потомство крыс, получавших экстракт элеутерококка – больше на 6,4 %, чем интактные крысята, а потомство крыс, получавших смесь растительных экстрактов – меньше на 73,7 % (Manna-Whitney: U=105,3000, Z = 2,874147, при р=0,002954) времени.

В ходе исследования вертикальных стоек в открытых рукавах крысята всех групп не совершали, а в закрытых рукавах приподнятого крестообразного лабиринта потомство крыс, получавших водные растительные экстракты, совершало меньше вертикальных стоек, чем интактные крысята: потомство крыс, получавших экстракт центеллы азиатской – меньше на 31,9 % (Manna-Whitney: U=124,7000, Z = 3,477854, при р=0,000113), потомство крыс, получавших экстракт гинкго билоба – меньше на 28,8 % (Manna-Whitney: U=161,0000, Z = 2,458252, при р=0,000012), потомство крыс, получавших экстракт элеутерококка – меньше на 6,2 %, чем интактные крысята, а потомство крыс, получавших смесь растительных экстрактов – меньше на 59,1 % (Manna-Whitney: U=171,2000, Z =3,655852, при р=0,000145).

Уровень депрессии оценивался в тесте «отчаяния» по Porsolt, суть которого состоит в том, что после помещения в стеклянный цилиндр диаметром 20 см и высотой 40 см, на 1/3 заполненный водой с температурой 25±1 °С, животное активно пытается выбраться из воды, плавая и совершая прыжки вверх, нырки под воду в поисках выхода, затем замирает в воде в характерной позе (иммобилизация). Выраженность депрессии оценивается по латентному времени до первой иммобилизации крысы, по длительности времени иммобилизации, по количеству попыток выбраться из воды, оцененных в опыте течение 5 минут (табл. 2).

При оценке времени активного плаванья установлено, что потомство крыс, получавших экстракт центеллы азиатской демонстрировало большее на 14,1 % (Manna-Whitney: U=113,500, Z = 3,245514 при р=0,002567) время плаванья по сравнению с контролем; потомство крыс, получавших экстракт гинкго билоба – большее на 10,6 % (Manna-Whitney: U=175,600, Z = 3,298584 при р=0,000000), а потомство крыс, получавших экстракт элеутерококка характеризовалось примерно одинаковым с интактными крысами временем плаванья. Потомство крыс, получавших смесь растительных экстрактов демонстрировало большее на 25,5 % (Manna-Whitney: U=151,3000, Z = 3,456565 при р=0,000011) время плаванья по сравнению с контролем.

Потомство крыс, получавших водные растительные экстракты, кроме экстракта элеутерококка (латентное время было, как в контроле), характеризовались большим латентным временем по сравнению с крысятами контрольной группы: потомство крыс, получавших экстракт центеллы азиатской демонстрировало меньшее латентное время на 14,4 % (Manna-Whitney: U=112,5000, Z = 3,245414, при р=0,000000); потомство крыс, получавших экстракт гинкго билоба – меньшим на 10,9 % (Manna-Whitney: U=135,6000, Z = 3,214241, при р=0,000113), потомство крыс, получавших смесь растительных экстрактов – меньшим на 21,0 % (Manna-Whitney: U=141,6000, Z = 5,245575, при р=0,000000) латентным временем.

Оценка числа попыток выбраться показала, что крысята экспериментальных групп совершали попытки чаще, чем контроль: потомство крыс, получавших экстракт центеллы азиатской совершало попытки чаще, чем интактные крысы на 32,9 % (Manna-Whitney: U=105,000, Z = 2,547746 при р=0,00000), потомство крыс, получавших экстракт гинкго билоба – чаще на 38,6 % (Manna-Whitney: U=193,200, Z = 3,848957 при р=0,002114), потомство крыс, получавших экстракт элеутерококка – чаще на 4,9, а потомство крыс, получавших смесь растительных экстрактов – чаще на 60,6 % (Manna-Whitney: U=146,500, Z = 4,847757 при р=0,000000).

Потомство крыс, получавших водные растительные экстракты, характеризовалось меньшим временем пассивного плаванья по сравнению с крысятами контрольной группы: потомство крыс, получавших экстракт центеллы азиатской демонстрировало меньшее время на 20,8 % (Manna-Whitney: U=96,7000, Z = 2,966566, при р=0,000009); потомство крыс, получавших экстракт гинкго билоба – меньшим на 17,7 % (Manna-Whitney: U=109,7000, Z = 3,444544, при р=0,003454), потомство крыс, получавших экстракт элеутерококка – меньшим на 9,5 % (Manna-Whitney: U=118,6000, Z = 3,688584, при р=0,003201), а потомство крыс, получавших смесь растительных экстрактов – меньшим на 38,1 % (Manna-Whitney: U=129,4000, Z = 5,245541, при р=0,003222) временем пассивного плаванья.

Потомство крыс, получавших водные растительные экстракты, характеризовалось меньшим временем иммобилизации по сравнению с крысятами контрольной группы: потомство крыс, получавших экстракт центеллы азиатской демонстрировало меньшее время на 22,1 % (Manna-Whitney: U=134,8000, Z = 3,112141, при р=0,000000); потомство крыс, получавших экстракт гинкго билоба – меньшим на 27,9 % (Manna-Whitney: U=117,9000, Z = 3,565858, при р=0,002994), потомство крыс, получавших экстракт элеутерококка – меньшим на 11,7 % (Manna-Whitney: U=148,0000, Z = 3,856636, при р=0,000000), а потомство крыс, получавших смесь растительных экстрактов – меньшим на 54,7 % (Manna-Whitney: U=196,0000, Z = 4,232252, при р=0,002222) временем пассивного плаванья.

Оценка числа болюсов во время теста показала, что крысята экспериментальных групп характеризовались меньшим количеством болюсов, чем контроль: потомство крыс, получавших экстракт центеллы азиатской – меньшим на 37,3 % (Manna-Whitney: U=99,000, Z = 2,998589 при р=0,002696), потомство крыс, получавших экстракт гинкго билоба – меньше на 38,9 % (Manna-Whitney: U=152,600, Z = 3,666654 при р=0,000000), потомство крыс, получавших экстракт элеутерококка – меньше на 18,9 (Manna-Whitney: U=124,5000, Z = 3,775774 при р=0,004952), а потомство крыс, получавших смесь растительных экстрактов – меньше на 40,6 % (Manna-Whitney: U=111,500, Z = 4,252535 при р=0,000003).

Потомство крыс, получавших водные растительные экстракты, кроме экстракта элеутерококка, чаще, чем интактные животные осуществляли свешивание с рукавов крестообразного лабиринта, чаще посещали открытые и закрытые рукава лабиринта, чем крысята интактной группы и проводили больше времени в открытых рукавах, нежели в закрытых, проводили меньше времени в центре приподнятого крестообразного лабиринта и не совершали груминг в открытых рукавах. В закрытых рукавах приподнятого крестообразного лабиринта крысята всех групп совершали груминг, но потомство крыс, получавших водные растительные экстракты, кроме экстракта элеутерококка, характеризовались меньшим временем груминга, чем крысята контрольной группы. В ходе исследования вертикальных стоек в открытых рукавах крысята всех групп не совершали, а в закрытых рукавах приподнятого крестообразного лабиринта потомство крыс, получавших водные растительные экстракты, совершало меньше вертикальных стоек, чем интактные крысята.

В целом, увеличение времени нахождения в открытых рукавах установки и уменьшение – в закрытых свидетельствует о меньшем уровне тревожности у крысят.

Уровень депрессии оценивался в тесте «отчаяния» по Porsolt. При оценке времени активного плаванья установлено, что потомство крыс, получавших водные растительные экстракты, кроме экстракта элеутерококка,   демонстрировало большее время плаванья по сравнению с контролем; характеризовались большим латентным временем; большим количеством попыток выбраться показала; меньшим временем пассивного плаванья, меньшим временем иммобилизации по сравнению с крысятами контрольной группы. Также крысята экспериментальных групп характеризовались меньшим количеством болюсов, чем контроль. Особенно выражены вышеуказанные параметры зафиксированы у крысят, рожденных от самок, получавших смесь растительных экстрактов.

Водные экстракты центеллы азиатской, гинкго билоба и элеутерококка обладают выраженной ноотропной активностью, так как оценка уровня тревожности животных в тесте «Приподнятый крестообразный лабиринт» и уровня депрессии в тесте «поведение отчаяния» по Porsolt показывают существенную разницу в поведении интактных крыс и потомства крыс, получавших в качестве дополнительной нагрузки водные растительные экстракты и наиболее выраженный эффект наблюдается при комплексном применении экстрактов центеллы азиатской и гинкго билоба.