Антибиотикорезистентность микрофлоры кузнечиков
Антибиотикорезистентность микрофлоры кузнечиков
Аннотация
Прямокрылые, включая как короткорогих, так и длиннорогих кузнечиков, являются ключевыми травоядными в пастбищных экосистемах по всему миру и являются одной из наиболее важных групп насекомых с экологической и экономической точек зрения. В статье рассматривается устойчивость микроорганизмов кузнечиков к антибиотикам и значение кузнечиков как резервуаров антибиотико-резистентных микроорганизмов. Установлена относительная схожесть микрофлоры исследованных кузнечиков, что, вероятно, связано с местом их обитания и тесным взаимодействием с растительной микрофлорой. У кузнечиков чаще всего встречаются Proteobacteria spp., Enterobacte spp., Lactococcus spp. и Bacillus spp. Показано, что микроорганизмы исследованных кузнечиков обладают мультирезистентностью к использованным антибиотикам. Наибольшей мультирезистентностью отличаются такие виды, как Bacillus spp. и Enterobacter spp. Чаще всего исследованные кузнечики обладали устойчивостью к фосфомицину, оксациллину, кларитромицину, линкомицину и тобрамицину. Наши исследования показывают, что кузнечики действуют как резервуары антибиотико-резистентных микроорганизмов, которые они впоследствии распространяют в окружающей среде, реализуя горизонтальный перенос генов.
1. Введение
Кузнечики относятся к прямокрылым и являются основными травоядными в глобальной пастбищной экосистеме. Они имеют огромное экологическое и экономическое значение. Травоядные кузнечики используют свои кишечные бактерии для извлечения питательных веществ из неперевариваемых тканей растений [1]. Из-за потребления большого количества растительной биомассы кузнечики являются наиболее важными первичными потребителями и играют важную роль в поддержании экологического баланса [2]. Кузнечики также считаются ключевым индикатором стабильности пастбищных экосистем, особенно в местах обитания, находящихся под угрозой исчезновения, таких как луга [1].
Насекомые связаны с множеством различных микробов, роль которых в формировании взаимодействия насекомых и растений мы только начинаем понимать. Помимо прямой выгоды от симбиотического микробного метаболизма, насекомые получают и передают микробы в окружающей среде, что делает их идеальными переносчиками и потенциальными бенефициарами болезней растений и микробов, которые изменяют защитные свойства растений [3].
Взаимоотношения с микробными симбионтами наблюдаются у многих насекомых. Они имеют решающее значение для их выживания и развития. Эндосимбионты могут оказывать глубокое влияние на экологию и эволюцию насекомых и управлять совместной эволюцией растений и травоядных [4]. Но эндосимбионты могут быть носителями генов устойчивости к антибиотикам. Устойчивость к противомикробным препаратам является глобальной проблемой для здоровья, как животных, так и людей. Микроорганизмы способны реализовывать биохимические механизмы и генетические процессы, которые снижают эффективность антибиотиков [5], [6].
Инфекции, вызванные бактериями с множественной лекарственной устойчивостью, представляют собой растущую проблему из-за появления и распространения резистентности микробов к лекарственным препаратам и отсутствия разработки новых противомикробных препаратов.
Устойчивость к антибиотикам развивается в результате воздействия антимикробных агентов на популяции и сообщества бактерий. Аналогичный обмен на генетическом уровне происходит между антибиотико-резистентными микроорганизмами, попавшими в окружающую среду, и естественной бактериальной микрофлорой [7], [8], [9].
Бактерии выработали древние механизмы, позволяющие противостоять воздействию молекулы антибиотика. Устойчивость к антибиотикам кодируется несколькими генами, многие из которых могут передаваться между бактериями [10], [11], [12].
Таким образом, насекомые представляют собой возможный путь распространения детерминант устойчивости к антибиотикам в окружающей среде. Поэтому целью и задачами настоящего исследования является изучение микрофлоры кузнечиков и определение ее резистентности к антибиотикам.
2. Объекты и методы исследования
Объектами исследования служили следующие прямокрылые насекомые (n=10):
· Кузнечик серый (Decticus verrucivorus).
· Певчий кузнечик (Tettigonia cantans).
· Кузнечик Резеля (Metrioptera Roeselii).
· Кустолюбка пепельная (Pholidoptera Griseoaptera).
Насекомых вылавливали в парках, в луговых и лесных массивах. Пойманных насекомых стерильным пинцетом помещали в стерильные пробирки и выдерживали в течение 3 часов. После этого насекомых выпускали.
В лабораторных условиях в каждую пробирку заливали по 5 мл стерильного физиологического раствора. После встряхивания из каждой пробирки переносили стерильной пипеткой по 1 мл физиологического раствора в 2 пустые стерильные чашки Петри, которые заливали питательным агаром, остуженным до 40–45ОС. После застывания среды чашки переворачивали кверху дном и термостатировали при температуре 30ОС в течение 48 часов. Выделенные из образцов бактерии идентифицировали стандартными микробиологическими методами на основании их морфологических и биохимических характеристик, а также методом масс-спектрометрии на анализаторе MALDI-TOF MS autoflex speed (фирма Bruker).
Определение чувствительности бактерий к антибиотикам осуществляли диффузионным методом с использованием дисков, пропитанных антибиотиками (табл. 1).
Таблица 1 - Перечень использованных антибиотиков
№ п/п | Наименование | Концентрация, мкг | Обозначение |
1 | Оксациллин | 10 | ОКС |
2 | Кларитромицин | 15 | KTM |
3 | Бензилпенициллин | 10 | ПЕН |
4 | Тобрамицин | 30 | ТОВ |
5 | Фуразолидон | 5 | ФРН |
6 | Доксициклин | 30 | ДОК |
7 | Ломефлоксацин | 5 | ЛОМ |
8 | Фосфомицин | 200 | ФОС |
9 | Олеандомицин | 15 | ОЛЕ |
10 | Неомицин | 30 | НЕО |
11 | Тетрациклин | 30 | TET |
12 | Ампициллин | 10 | AMP |
13 | Левомицетин | 30 | ЛЕВ |
14 | Линкомицин | 15 | ЛИН |
После инкубации были измерены зоны ингибирования роста микроорганизмов (табл. 2).
Таблица 2 - Оценка чувствительности микроорганизмов к антибиотикам по зоне задержки роста
Уровни устойчивости к антибиотику | Диаметр зон ингибирования роста, мм |
Высокий | > 25 |
Средний | от 16 до 25 |
Низкий | <15 |
Статистическую обработку результатов исследования проводили с использованием табличного процессора Microsoft Excel.
3. Результаты и обсуждение
Общими для всех видов кузнечиков были Lactobacillus spp., Enterobacter spp., Bacillus spp. и Enterococcus spp. У некоторых кузнечиков были выделены Actinobacteria spp., Proteobacteria spp. и Firmicutes spp.
Общее количество микроорганизмов, выделенных из кузнечиков, варьировало от 10×4 КОЕ до 10×6 КОЕ. Исследования показали относительную схожесть микрофлоры исследованных насекомых (табл. 3). На это, вероятно, влияет связь микробиоты насекомых с местом обитания и тесным взаимодействием с растительной микрофлорой.
Таблица 3 - Микробный пейзаж кузнечиков
Наименование насекомых | Общее количество микроорганизмов, КОЕ | Выделенные микроорганизмы |
Decticus verrucivorus | 10×6 | Lactobacillus spp., Enterobacter spp., Bacillus spp., Enterococcus spp., Actinobacteria spp., Proteobacteria spp. |
Tettigonia cantans | 10×4 | Lactobacillus spp., Enterobacter spp., Bacillus spp., Enterococcus spp., Proteobacteria spp., Firmicutes spp. |
Metrioptera Roeselii | 10×5 | Lactobacillus spp., Enterobacter spp., Bacillus spp., Enterococcus spp., Proteobacteria spp., Firmicutes spp., Actinobacteria spp. |
Pholidoptera Griseoaptera | 10×4 | Lactobacillus spp., Enterobacter spp., Bacillus spp., Enterococcus spp., Proteobacteria spp. |
Соотношение микроорганизмов, входящих в микробиом кузнечиков, отличается более выраженным представительством Lactobacillus spp., Enterobacter spp, Bacillus spp., Enterococcus spp. (рис. 1).
Рисунок 1 - Соотношение представителей микрофлоры, входящей в микробиом кузнечиков
Рисунок 2 - Уровень резистентности кузнечиков к антибиотикам
Рисунок 3 - Антибиотикограмма резистентности микрофлоры кузнечиков
4. Заключение
1. Общими для всех видов кузнечиков были Lactobacillus spp., Enterobacter spp., Bacillus spp. и Enterococcus spp.
2. Общее количество микроорганизмов, выделенных из кузнечиков, варьировало от 10×4 КОЕ до 10×6 КОЕ.
3. Соотношение микроорганизмов, входящих в микробиом кузнечиков, отличается более выраженным представительством Lactobacillus spp., Enterobacter spp, Bacillus spp., Enterococcus spp.
4. Чаще всего исследованные кузнечики обладали устойчивостью к фосфомицину, оксациллину, кларитромицину, линкомицину, ампициллину, бензилпенициллину, олеандомицину и тобрамицину.
5. Уровень резистентности изолятов к антибиотикам варьирует у кузнечиков от 14,3% до 78,6%.