ПОДБОР ГЕНОВ ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ SALMONELLA ENTERITIDIS

ПОДБОР ГЕНОВ ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ SALMONELLA ENTERITIDIS

Научная статья

Семина А.Н.*

ORCID: 0000-0001-7641-9105,

Всероссийский научно-исследовательский ветеринарный институт птицеводства - филиал Федерального государственного бюджетного научного учреждения Федерального научного центра «Всероссийский научно исследовательский и технологический институт птицеводства» Российской академии наук, Санкт-Петербург, Россия

* Корреспондирующий автор (anna14.05[at]mail.ru)

Аннотация

В настоящее время одним из широко применяемых методов лабораторной диагностики сальмонеллёза является метод полимеразно цепной реакции (ПЦР). В данной работе показана возможность использования ПЦР в сочетании с методом секвенирования для выявления и последующей идентификации Salmonella Enteritidis. В качестве гена маркера для анализа проведя аналитический обзор был выбран ген sefA. Данная область содержит участки с высокой степенью консервативности, что является необходимым условием выбора праймеров для ПЦР. Предлагаемые праймеры обеспечивают выявление Salmonella Enteritidis в биологических материалах за короткий промежуток времени.

Ключевые слова: сальмонеллёз, птица, гены, ПЦР. 

SELECTING GENES FOR SALMONELLA ENTERITIDIS IDENTIFICATION

Research article

Semina A.N.*

ORCID: 0000-0001-7641-9105,

All-Russian Scientific Research Veterinary Institute of Poultry Farming – Branch of the Federal State Budget Scientific Institution of the Federal Scientific Center “All-Russian Scientific and Technological Institute of Poultry Farming” Russian Academy of Sciences, St. Petersburg, Russia

* Corresponding author (anna14.05[at]mail.ru)

Abstract

Currently, polymerase chain reaction method (PCR) is one of the most widely used methods of laboratory diagnosis of salmonellosis. This paper shows the possibility of using PCR in combination with the sequencing method to detect and subsequently identify Salmonella Enteritidis. The sefA gene was selected as a marker gene for analysis after an analytical review. This field contains areas with a high degree of conservatism, which is a prerequisite for selecting primers for PCR. The proposed primers ensure the identification of Salmonella Enteritidis in biological materials within a short period.

Keywords: Salmonellosis, bird, genes, PCR.

Каждый год в обществе фиксируют рост заболеваемости сальмонеллёзом у животных и людей. Всемирная пандемия сальмонеллеза, связанная с яичной продукцией, началась в 70-х гг. и в настоящее время постепенно идет на снижение вследствие внедрения специальных программ применяемых правительством разных государств и птицеводческой индустрии. Заболевание в главном обусловлено сальмонеллами, принадлежащими к серотипу S. Еnteritidis [1]. Этот серовар проявляет значительное воздействие на состояние здоровья из-за его возможности контаминировать яйца. Зачастую факторами болезни людей S. Еnteritidis является: несоблюдение сохранения яиц, неправильное обращение с ними либо употребление яиц в пищу в сыром виде [2]. Высокая распространенность S. Еnteritidis в столовых яйцах не полностью соответствует превалированию данного штамма у кур-несушек. Различные сероварианты сальмонелл (кроме Enteritidis) выделяют от зараженных несушек в 25-50% случаев, тогда как более чем 90% изолятов, выделенных из куриных яиц, относятся к серотипу Enteritidis [3]. Это доказывает, что S. Еnteritidis обладает характерными особенностями, которые позволяют ей специфически взаимодействовать с репродуктивными органами кур, компонентами яиц, обеспечивая выживание и накопление в них. Контаминация яиц сальмонеллами происходит либо снаружи, либо внутри яйца. Поверхностное обсеменение, как правило, возникает при наличии сальмонелл в окружающей среде, либо при прохождении яйца по клоаке [4]. Присутствие сальмонелл внутри яйца обусловлено их проникновением непосредственно через скорлупу, или колонизацией репродуктивных органов. В данном случае инфицирования яиц сальмонеллами совершается в ходе их развития. Серовар Enteritidis значительно больше заселяет репродуктивные органы птицы согласно сопоставлению с иными серотипами. Помимо этого, данный представитель сальмонеллеза выделяется высокой выживаемостью в белке яйца, который обладает противомикробными качествами. Поэтому принято считать, что S. Еnteritidis является ключевым патогенном, контаминирующим яйца. Очевидно, что серовар Enteritidis также обнаруживаются у бройлеров, и именно они представляют собой определенную проблему, связанную с пищевыми отравлениями людей [5]. Обширное распространение и финансовая значимость серотипа S. Еnteritidis делают актуальной задачу скорого и надежного выявления возбудителя этого заболевания. Обнаружение S. Еnteritidis в биологических объектах проводится способом полимеразно цепной реакции. В данной реакции применяются праймеры обладающие специфичностью на определенную область генома. Разнообразные гены сальмонелл могут быть использованы в качестве генетических маркеров. Некоторые ученные применяют способ идентификации S.Enteritidis согласно их генетическому маркеру − гену spvA. Данный ген располагается на большой плазмиде вирулентности, имеется у 80% изолятов сальмонелл. [6], [7]. Имеются ряд сведений об использовании способа ПЦР с целью раскрытия сальмонелл в области гена invA, используемого для инвазии [8], [9]. Имеются сообщения о применении видоспецифической части гена fimA, которая используется с целью идентификации сальмонелл, шифрующий главную субъединицу фимбрий, что имеется у абсолютно всех агентов семейства сальмонелл и в том числе и у не обладающих жгутиков агентов [10]. Также может быть использована детекция гена sefA для идентификации таких сероваров как: S.Enteritidis, S.Pullorum и S.Gallinarum.

Исследование филогенетических деревьев, созданных в базе последовательностей генов invA и sefA, указывает, то что данная зона хромосомы сальмонелл была получена сальмонеллами вследствие горизонтального перенесения ещё вплоть до дифференциации в серовары изнутри S. Enterica, а никак не вследствие дальнейшего перенесения среди штаммов разных сероваров, по этой причине свойственные изменении локализованных в их генах, возможно рассматривать генетическими маркерами сероваров.

Подбор генов мишеней осуществляли в ряд стадий: подбор генов-мишеней с целью идентификации S. Enteritidis; подбор олигонуклеотидных праймеров; определение условий проведения ПЦР с целью обнаружения S. Enteritidis.

Подбор генов-мишеней с целью идентификации S. Enteritidis.

Главным условием патогенности S. Enteritidis считается умение формировать низкокопийные высокомолекулярные плазмиды, кодирующие условия вирулентности. Этот фактор находится в хромосоме, его выработка закодирована на гене sefA. Отталкиваясь от данного свойства в качестве мишеней для подбора уникальных олигонуклеотидных последовательностей были выбраны участки гена sefA, кодирующие РНК-полимеразу и рибосомальные белки.

Вследствие рассмотрения имеющейся информации нуклеотидных последовательностей были отобраны специфические праймеры - «SEFA-1» и «SEFA-2» с целью отличительной амплификации ДНК гена sefA. Праймеры амплифицируют фрагмент ДНК sefA длиной 420 п.н. Общетеоретические исследование комплиментарности праймеров гена sefA, выполненные с помощью компьютерных программ, выявил наибольшую их гомологию с избранными ДНК-мишенями.

Состав подобранных праймеров удовлетворяет общепризнанным законам: отсутствие самокомплиментарности 3'-концов любого олигонуклеотида, отсутствие комплеметартности 3'-точек прямых и обратных праймеров, отсутствие второстепенных строений, отсутствие тугоплавких повторов (наиболее 3-х GC) в 3'-окончании любого праймера, отсутствие неоднократных AT (либо GC)-повторов изнутри любого праймера.

Подбор олигонуклеотидных праймеров

Выбранные последовательности олигонуклеотидов показали гомологию только с геном sefA и никак не установлено их существенной гомологии с нуклеотидными последовательностями генов иных микроорганизмов, микробов либо эукариотов. Специфичность оценивали с помощью специализированных программ FASTA и BLAST on-line. Исходя из теоретических расчетов, предложенные праймеры должны иметь 100% специфичность.

Определение условий проведения ПЦР с целью обнаружения S. Enteritidis

Установлено, то что результативность ПЦР находится в зависимости от температуры отжига праймеров, их концентрации, насыщенности ионов Mg2+, а кроме того от количества циклов амплификации и количественного соотношения ДНК-матрицы. Для получения стабильных результатов необходимо было модифицировать эти параметры.

Объем ионов Mg2+ модифицировали с 0,5 мМ вплоть до 2,5 мМ. Как правило, с увеличением концентрации Mg2+, прослеживается повышение концентрации специфического продукта взаимодействия, то, что отмечалось и в этом случае. Подходящей концентрацией Mg2+ для тестируемых праймеров, которая гарантирует большую отдачу специфического продукта реакции в отсутствии добавочных не специфических фрагментов подобрана концентрация 1мМ.

Результативность амплификации присутствие различных температурах отжига исследовали в отдельности для каждой пары праймеров. В качестве ДНК-матрицы применяли поочередные 10-ти кратные разведения ДНК S. Enteritidis. Изменение температуры отжига праймеров в спектре с 50°С вплоть до 59°С на восприимчивость теста не оказывало влияния, в случае как повышение температуры отжига вплоть до 62°С понижало восприимчивость амплификации ДНК sefA. Вместе с тем, при температуре отжига 50°С, в абсолютно всех вариантах прослеживались неспецифические части. В итоге проделанных исследований была установлена наилучшая температура отжига, равная 57°С, присутствие которой в одинаковой мере благополучно функционируют как праймеры «SEFA-1», так и праймеры «SEFA-2», то что разрешило в последующем совместить их в одной консервативной консистенции. С целью уменьшения себестоимости теста и избежания вероятных неспецифических взаимодействий была выбрана наилучшая концентрация праймеров.

Число праймеров в реакционной смеси модифицировали с 2 вплоть до 15 пмоль. Подходящее содержание праймеров «SEFA-1», «SEFA-2» в реакционной смеси - 1 пмоль. В процессе эксперимента определено, что повышение количества праймеров до 15 пмоль понижало восприимчивость ПЦР в 10 раз, а уменьшение количества праймеров до 1 пкм никак не воздействовало на чувствительность реакции.

С целью установления специфичности подобранных олигонуклеотидных праймеров использовали культуру бактерий Salmonella Enteritidis, имеющихся в коллекции микроорганизмов отдела микробиологии ВНИВИП. Экстрагирование ДНК с суспензии клеточных линий и лиофилизированного штамма сальмонелл применяли комплект реагентов "ДНК-сорб В" («Амплисенс», Рф). Анализировали продукты амплификации методом горизонтального электрофореза в 1,5 - 1,8% агарозном геле и 10X ТВЕ буфере, включающем бромистый этидий в концентрации 0,25 мкг/мл, с дальнейшей регистрацией итогов гель-документирующей системе. Амплифицированные фрагменты ДНК выявляются в виде светящихся оранжевых полос. Содержащими культуру бактерии Salmonella Enteritidis считались пробы, у которых полосы в геле располагались на уровне полосы маркера соответствующих 420 п.н.

В результате проведенной работы были определенны основные гены-мишени (гена sefA) и на их основании подобраны специфические праймеры («SEFA-1» и «SEFA-2») с помощью которых можно идентифицировать Salmonella Enteritidis. Подобранные нами уникальные последовательности олигонуклеотидов позволяют с высокой специфичностью в течение 8 часов проводить выявление Salmonella Enteritidis.

Конфликт интересов Не указан.

Conflict of Interest None declared.

Список литературы / References

1. Rapid outbreak assessment. Unusual increase of Salmonella Mikawasima infections in humans // European Centre for Disease Prevention and Control, Stockholm, 28 November 2013. – P. 1–9.
2. Lan R. Population structure, origins and evolution of major Salmonella enterica clones / Lan R., Reeves P. R., Octavia S // Infect Genet Evol. – 2009. – Vol. 9(5). – P. 996–1005.
3. Julie R. Recent Multistate Outbreaks of Human Salmonella Infections Acquired from Turtles: A Continuing Public Health Challenge / R. Julie // Clinical Infectious Diseases. – 2010. – Vol. 50. – P. 554–559.
4. Knutsson R. Detection of Salmonella spp. in fecal specimens by use of real-time polymerase chain reaction assay / R.Knutsson, H. Grage, J. Hoorfar // Am. J. Vet. Res. – 2002 – Vol. 63. – P.1265–1268.
5. Herrera-Leo S. Multiplex PCR for Distinguishing the Most Common Phase-1 Flagellar Antigens of Salmonella spp. / S. Herrera-Leo, J.R. McQuiston, M. A. Usera // J. Clin. Microbiol. – 2004. – Vol. 42, No. 6. – P. 2581–2586.
6. Hoorfar J. Automated 5’ Nuclease PCR Assay for Identification of Salmonella enterica/ Hoorfar J., Ahrens P., Radstrom P. // J.Clin. Microbiol. – 2000. – Vol. 38, No. 9. – P. 3429–3435.
7. Kim S. Multiplex PCR-Based Method for Identification of Common Clinical Serotypes of Salmonella enterica subsp. Enterica / S. Kim, J. G. Frye, J. Hu // J. Clin. Microb. – 2006. – P.3608–3615.
8. Malorny B. Diagnostic Real-Time PCR for Detection of Salmonella in Food / B. Malorny, E. Paccassoni, P. Fach e.a. // Appl. Environm. Microbiol. – 2004. – Vol. 70, No. 12. – P. 7046–7052.
9. Rapid risk assessment. Multi-country outbreak of Salmonella Stanley infections // European Centre for Disease Prevention and Control, Stockholm, 27 July 2012. – P. 1–6.
10. Hopkins K.L. Standardisation of multilocus variable-number tandem-repeat analysis (MLVA) for subtyping of Salmonella enterica serovar Enteritidis / Hopkins K. L., Peters T. M., de Pinna E. and others // Euro Surveill. – 2011. –Vol. 16(32).