ACCUMULATION OF GROWTH FACTORS IN THE EYE TISSUES AFTER INFILTRATION OF CRYOPRESERVED CORD BLOOD NUCLEATED CELLS (CCBNC)

Свидко Е.Н. ¹, Рязанцев В.В. ², Бабийчук Л.А. ³, Дёмин Ю.А. ⁴

¹Врач-офтальмолог ММЦ Офтальмика, ² Кандидат биологических наук, ³Доктор биологических наук, Профессор, Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины, ⁴Доктор медицинских наук, Профессор, Харьковская медицинская академия последипломного образования

ХАРАКТЕР НАКОПЛЕНИЯ РОСТОВЫХ ФАКТОРОВ В ТКАНЯХ ГЛАЗА ПОСЛЕ ВВЕДЕНИЯ КРИОКОНСЕРВИРОВАННЫХ ЯДРОСОДЕРЖАЩИХ КЛЕТОК КОРДОВОЙ КРОВИ (кЯКККЧ)

Аннотация

В данной работе было исследовано содержание трансформирующего фактора роста TGF-β1 и нейротрофического фактора мозга BDNF  в зоне лимба роговицы после введения криоконсервированных ядросодержащих клеток кордовой крови (кЯКККЧ) в экспериментальной модели лимбальной недостаточности роговицы (ЛНР). Криоконсервирование ЯКККЧ  проводили с высоким или с существенно сниженным содержанием декстрана. Было показано, что независимо от метода замораживания при введении кЯКККЧ животным с индукцией ЛНР в ткани роговицы наблюдается достаточно высокое содержание BDNF и TGF-1b, что способствует улучшению регенерации клеток лимба, эпителия и стромы роговицы глаза.

Ключевые слова: криоконсервирование, лимбальная недостаточность роговицы, ядросодержащие клетки кордовой крови, ростовые факторы.

Svidko E.N.¹, Ryazantsev V.V.², Babijchuk L.A.³, Dyomin Yu.A.⁴

¹Ophthalmologist, International Medical Centre Oftalmika, ²PhD in Biology, ³PhD in Biology, Professor, Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine, ⁴MD, Professor, Kharkiv Medical Academy of Postgraduate Education

ACCUMULATION OF GROWTH FACTORS IN THE EYE TISSUES AFTER INFILTRATION OF CRYOPRESERVED CORD BLOOD NUCLEATED CELLS (CCBNC)

Abstract

In this research level of the transforming growth factor TGF-β1 and brain-derived neurotrophic factor BDNF in limbus after the infiltration of cryopreserved cord blood nucleated cells (CCBNC) in experimental model of limbal stem cells deficiency (LSCD) was investigated. Cryopreservation was performed with a high or significantly reduced level of dextran. It was shown that, regardless of the method of cryopreservation after infiltration of CCBNC in experimental LSCD, sufficiently high level of BDNF and TGF-1b was observed. This contributes improvement of limbal cells regeneration, epithelium and corneal stroma.

Keywords:  cryopreservation,  limbal stem cells deficiency,  cord blood nucleated cells,  growth factors.

Многие заболевания органа зрения человека, особенно хронические, характеризуются вовлечением в патологический процесс зоны лимба [8]. При этом наблюдается как снижение количества стволовых лимбальных клеток, способных к делению, так и изменение состояния микроокружения клеток лимба - специфических ростовых регуляторов, таких как фактор роста эпителия (EGF), трансформирующий ростовой фактор (TGF), различные нейротрофические ростовые факторы. В современной офтальмологии интенсивно развивается новое направление - клеточная терапия с применением ЯКККЧ [1, 9]. Все чаще для лечения многих патологий эффективно используется ЯКККЧ как источник гемопоэтических стволовых клеток, а также благодаря содержанию в ней большого количества биологически активных веществ и ростовых факторов [7, 10]. Одним из наиболее эффективных методов длительного хранения ЯКККЧ в полноценном состоянии является криоконсервирование [1, 4].

Традиционно используемым криопротектором является ДМСО, в данном случае с неизбежной примесью декстрана (в виде фармпрепарата полиглюкин). Однако, известно, что декстран имеет некоторые отрицательные качества. При его введении может возникать сенсибилизация и аллергические реакции.  Известно, что декстран используют в качестве пролонгаторов в глазных каплях, так как полисахариды способны делать структуру препарата более вязкой, а значит дольше сохранятся на роговице. Вследствие этого препарат кЯКККЧ с декстраном трудно набрать в шприц, а выполнение инфильтрации роговицы требует определенных навыков. Также декстран вызывает  отёк и утолщение роговицы. Это продлевает восстановительный период после введения. Полисахариды, и в частности декстран - хорошая среда для размножения бактерий. Потому повышается риск воспалительных заболеваний.

Цель работы — оценить характер содержания ростовых факторов (TGF-β1 и BDNF) в зоне лимба у кролей с индукцией ЛНР после введения кЯКККЧ, криоконсервированных разными методами.

Экспериментальная  работа была выполнена на кролях в возрасте 6 месяцев породы Шиншилла весом 2,0-2,5 кг (n=45). Для формирования экспериментальной ЛНР животным на область лимба выполняли аппликацию 0,04% раствора митомицина-С (ММС) в течение 3-х минут [4]. Из эксперимента животных выводили под наркозом путем воздушной эмболии через ушную вену. Исследования проводились согласно «Общим этическим принципам экспериментов на животных» (29.09.01), которые согласовываются с положением «Европейской конвенции о защите позвоночных животных, которые используются для экспериментальных и других научных целей» (Страсбург, 1985).

Использовали препарат «Криоцелл-гемоклетки» после его размораживания, содержащий 5% ДМСО и 3,6% декстрана (режим 1). В части экспериментов использовали такой же препарат, содержащий сниженное количество декстрана (не более 0,4%), который при традиционном способе выделения ЯКККЧ из кордовой крови находится в среде замораживания в концентрации 3,6% (режим 2) [2, 6]. В обоих случаях при криоконсервировании применяли 2-х этапный режим замораживания согласно методу [2, 6].

Введение кЯКККЧ проводили в зону лимба по 8 меридианам в объеме 0,2 мл в концентрации 500тыс клеток в один глаз. Все кролики разделены на 3 группы: 1 - здоровые с введением кЯКККЧ, 2 - ЛНР с введением кЯКККЧ (режим криоконсервирования 2), 3 - ЛНР с введением кККК (режим криоконсервирования 1). Анализ проводимой терапии у кролей осуществляли на 1, 3, 7, 14 и 21 сутки.

Для исследования концентрации ростовых факторов готовили осветлённый гомогенат из роговицы кроля, освобожденный центрифугированием от измельченных остатков ткани и клеток. Для его получения брали 50 мг ткани роговицы глаза, измельчали в пробирке «Эппендорф» объёмом 1,5 мл с помощью микро-гомогенизатора Поттера в физиологическом растворе на фосфатном буфере с рН 7,4 с добавлением 1 мМоля ингибитора протеаз фенилметилсульфонилфлуорида. Соотношение ткань – раствор составляло 1:10. После получения гомогената его осветляли центрифугированием при 3000 g в течение 10 минут. Надосадок собирали в отдельную пробирку для дальнейшего измерения содержания BDNF и TGF-1b.

Для исследования концентрации ростовых факторов BDNF и TGF-1b использовали высокочувствительные тест-системы, в частности, для измерения TGF-1b тест-систему производства “DRG”, с чувствительностью 2 пг/мл, для измерения BDNF тест-систему “R&D Systems” Quantikine, с чувствительностью 20 пг/мл. Важным является использование нами тест-систем для измерения человеческих клеточных факторов роста, а не лабораторного животного, в данном случае кроля, так как при введении клеточного препарата в орган зрения использовали препарат из кордовой крови человека. Все измерения проводили согласно инструкции производителя, методом иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием полуавтоматического спектрофотометра для 96-луночных планшетов с вертикальным лучом StatFax 2400 (США). Из пробирки осветленного гомогената дозатором брали 0,1 мл и переносили в лунки планшета, в котором в дальнейшем проводили реакцию связывания TGF-1b и BDNF с пришитыми на дне лунок антителами, специфически взаимодействующими по принципу антиген-антитело. В дальнейшем проводили добавление вторичных антител и запускали ферментативную реакцию, которая давала окрашенный продукт. Измерение этого окрашенного продукта реакции проводили по данным предварительно настроенной калибровочной кривой.

Статистическую обработку полученных результатов проводили параметрическим методом с помощью t-критерия Стьюдента или непараметрическим методом Манна-Уитни.

После введения в зону лимба суспензии ЯКККЧ у кролей групп 2 и 3 наблюдали  повышение содержания в ткани роговицы ростовых факторов BDNF, TGF-1b. по сравнению с контрольной группой 1 (табл. 1).

 

Таблица 1 - Содержание факторов роста в  роговице кроликов после введения ЯКККЧ

Срок после введения ККЧ, сутки	Содержание TGF-1β пг/мл			Содержание BDNF пг/мл
	Группа 1	Группа 2	Группа 3	Группа 1	Группа 2	Группа 3
1	2,3±0,2	6,8±0,21,3	7,5±0,51,2	4,1±0,1	11,9±0,21,3	11,7±0,21,2
3	2,9±0,1	7,1±0,11,3	8,2±0,21,2	5,3±0,3	18±0,11,3	17,3±0,31,2
7	3,8±0,1	9,4±0,31,3	11±0,11,2	6,8±0,2	23,2±0,21,3	25,4±0,21,2
14	4,1±0,2	18,6±0,21,3	19,1±0,11,2	8,2±0,2	29,2±0,31,3	32,2±0,21,2
21	4,4±0,1	19,7±0,21,3	20,7±0,31,2	9,5±0,1	36,1±0,11,3	42,8±0,21,2

 

Очевидно, что такое нарастание содержания ФР в первый период после размораживания и введения ЯКККЧ в роговицу связано с повышенной проницаемостью клеток, подвергнутых замораживанию. В дальнейшем, в  срок наблюдения до 21 суток от момента введения в роговицу ЯКККЧ, степень нарастания концентрации ФР по сравнению с контрольной группой увеличивалась в 3 раза для BDNF и в 4 раза для TGF-1b.

Поскольку, нами отмечено присутствие ЯКККЧ в роговице в этот срок наблюдения, возможно по сравнению с контрольной группой наличие факторов роста в ткани глаза можно связать с ЯКККЧ. Исходя из полученных данных можно предположить, что введение ЯКККЧ независимо от метода криоконсервирования К1 или К2 способствуют поступлению ФК, необходимых для регенерации поврежденного лимба и роговицы. Очевидно, ЯКККЧ, введенные в зону лимба, поставляют  биологически активные вещества (BDNF, TGF-1b), причем эффект более выражен при развитии такой патологии, как ЛНР. Характер накопления ФК в тканях роговицы не отличается при введении ЯКККЧ, криоконсервированных в режиме 1 (К1), так и в режиме 2 (К2). Количество биологически активных веществ, обнаруживаемых в зоне лимба в срок до 21 суток от момента введения повышается с увеличением времени пребывания ЯКККЧ в роговице у кролей, и существенно выше на 21-е сутки, чем у кролей с развитием ЛНР. Таким образом, снижение содержания декстрана в среде замораживания не приводит к существенному снижению жизнеспособности ККЧ после криоконсервирования по сравнению со стандартным методом получения и замораживания в среде с декстраном (К1).

Поддержание постоянства любой эпителиальной структуры, в том числе роговичного эпителия, обеспечивается популяцией СК, которые представляют собой уникальный источник регенерации клеток, как в физиологических условиях, так и при различных заболеваниях или травмах глаза [11]. В случае тотальной ЛНР необходима пересадка ауто- либо аллогенных СК. В настоящее время многие исследования направлены на выяснение механизмов регуляции процессов дифференцировки стволовых клеток. [12].

Можно предположить, что в этом случае происходит активация клеток эпителия роговицы и СК лимба вследствие влияния на них  биологически активных веществ ЯКККЧ - BDNF и TGF-1β. Известно, что BDNF принадлежит к классу цитокинов, семейству ФР и подсемейству нейротрофинов и обладает выраженными нейрозащитными свойствами, угнетает клеточный апоптоз, препятствует гибели нейронов и cтимулирует рост холинергических нервных волокон [3]. При экспериментальной ЛНР происходит резкое снижение содержания BDNF во внутриглазных структурах, поэтому важна компенсация его содержания, которую способны обеспечить, по всей видимости, ЯКККЧ. TGF-1β оказывает множественные влияния на различные типы клеток и участвует в регуляции роста клеток, их дифференцировке и апоптозе, а также в модуляции ИС, способствует заживлению ран. Наиболее важной следует считать его участие в регенерации тканей. Установлено, что TGF-1β активирует хемотаксис воспалительных клеток и синтез экстрацеллюлярного матрикса [5].

Выводы: Уже с первых суток после введения кЯКККЧ обеспечивают цитопротекцию и регенерацию клеток роговицы и лимба, в независимости от метода криоконсервирования, сохраняют свою целостность и после введения в орган зрения имеют нарастающий характер нарабатывания BDNF, TGF-1b, с постепенным возрастанием их концентрации до 21-х суток. Повышение секреции ростовых факторов после введения кЯКККЧ животным в экспериментальной модели ЛНР ускоряют процессы регенерации клеток лимба, эпителия и стромы роговицы. Полученные результаты экспериментального исследования позволяют рекомендовать применение кЯКККЧ в широкой офтальмологической практике при лечении ЛНР.

Литература

1. Абдулкадыров К.М. Заготовка плацентарной крови. Особенности ее клеточного состава и гемопоэтического потенциала / К.М. Абдулкадыров, Н.А. Романенко // Трансфузиология.– 2003.– Т.4, №1.– С. 44-46.
2. Бабийчук Л.А., Грищенко В.И., Зубов П.М., Зубова О.Л., Рязанцев В.В., Бабийчук Л.В., Кудокоцева О.В., Любчич С.А. Структурно-функциональное состояние и жизнеспособность ядросодержащих клеток пуповинной крови после криоконсервирования // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия.– 2010. – №3. – C. 77-81
3. Головко А.И.. Нейротрофические факторы головного мозга. Нейрохимические и наркологические аспекты. // Нейрохимия.– 2008.– Т.25.-№4.– C. 261-271
4. Милюдин Е.С. Экспериментальная модель недостаточности региональных стволовых клеток роговичного эпителия. Вестник СамГУ – Естественнонаучная серия. 2006. №9 (49). – С. 219 - 226
5. Никитин Н.А,, Ш.Р. Кузбеков. Роль TGFβ в офтальмологии.// Цитокины и воспаление.– 2009. Т. 8.– № 1. – С. 3-9
6. Пат. 92227 Україна, МПК А 01 N 1/02. Спосіб кріоконсервування ядровмісних клггин кордової крові, у тому числі стовбурових гемопоетичних клігин / Л.О. Бабійчук, В.І. Грищенко, Т.М. Гуріна та iн.; заявник та патентовласник Інститут проблем кріобюлогн i кріомедицини НАН України. – №200814009; заявл. 05.12.2008; опубл. 11.10.2010, Бюл.№19, 2010.
7. Broxmeyer H.E, Kurtzberg J., Gluckman E. et al. Umbilical cord blood hematopoietic stem and repopulation cells in human clinical transplantation// Criobiology.– 1995.–Vol.32, №6.– P. 511-515
8. Dua HS, Azuara-Blanco A. Limbal stem cells of the corneal epithelium.Surv Ophthalmol.2000 – №44(5) – P. 415-425.
9. Gluckman E. Current status of umbilical cord blood hematopoietic stem cell transplantation// Experimental hematology.– 2000.–Vol.28.–Pt.11.–P.1197-1205
10. Tseng SCG.Concept and application of limbal stem cells // Eye. – 1989.––№57 – P. 201-209.
11. Lavker, R. Corneal epithelial stem cells at the limbus: looking at some old problems from a new angle // Experimental eye research. – 2004. – Vol. 78.– P. 433-446.
12. Miri A, Al-Deiri B, Dua HS. Long-term outcomes of autolimbal and allolimbal transplants.Ophthalmology. – 2010. – №117(6). – P. 1207-1213.

References

1. Abdulkadyrov K.M. Zagotovka placentarnoj krovi. Osobennosti ee kletochnogo sostava i gemopojeticheskogo potenciala / K.M. Abdulkadyrov, N.A. Romanenko // Transfuziologija.– 2003.– T.4, №1.– S. 44-46.
2. Babijchuk L.A., Grishhenko V.I., Zubov P.M., Zubova O.L., Rjazancev V.V., Babijchuk L.V., Kudokoceva O.V., Ljubchich S.A. Strukturno-funkcional'noe sostojanie i zhiznesposobnost' jadrosoderzhashhih kletok pupovinnoj krovi posle kriokonservirovanija // Kletochnaja transplantologija i tkanevaja inzhenerija.– 2010. – №3. – S. 77-81
3. Golovko A.I.. Nejrotroficheskie faktory golovnogo mozga. Nejrohimicheskie i narkologicheskie aspekty. // Nejrohimija.– 2008.– T.25.-№4.– C. 261-271
4. Miljudin E.S. Jeksperimental'naja model' nedostatochnosti regional'nyh stvolovyh kletok rogovichnogo jepitelija. Vestnik SamGU – Estestvennonauchnaja serija. 2006. №9 (49). – S. 219 - 226
5. Nikitin N.A,, Sh.R. Kuzbekov. Rol' TGFβ v oftal'mologii.// Citokiny i vospalenie.– 2009. T. 8.– № 1. – S. 3-9
6. Pat. 92227 Ukraїna, MPK A 01 N 1/02. Sposіb krіokonservuvannja jadrovmіsnih klggin kordovoї krovі, u tomu chislі stovburovih gemopoetichnih klіgin / L.O. Babіjchuk, V.І. Grishhenko, T.M. Gurіna ta in.; zajavnik ta patentovlasnik Іnstitut problem krіobjulogn i krіomedicini NAN Ukraїni. – №200814009; zajavl. 05.12.2008; opubl. 11.10.2010, Bjul.№19, 2010.
7. Broxmeyer H.E, Kurtzberg J., Gluckman E. et al. Umbilical cord blood hematopoietic stem and repopulation cells in human clinical transplantation// Criobiology.– 1995.–Vol.32, №6.– P. 511-515
8. Dua HS, Azuara-Blanco A. Limbal stem cells of the corneal epithelium.Surv Ophthalmol.2000 – №44(5) – P. 415-425.
9. Gluckman E. Current status of umbilical cord blood hematopoietic stem cell transplantation// Experimental hematology.– 2000.–Vol.28.–Pt.11.–P.1197-1205
10. Tseng SCG.Concept and application of limbal stem cells // Eye. – 1989.––№57 – P. 201-209.
11. Lavker, R. Corneal epithelial stem cells at the limbus: looking at some old problems from a new angle // Experimental eye research. – 2004. – Vol. 78.– P. 433-446.
12. Miri A, Al-Deiri B, Dua HS. Long-term outcomes of autolimbal and allolimbal transplants.Ophthalmology. – 2010. – №117(6). – P. 1207-1213.