ИЗУЧЕНИЕ СТЕПЕНИ ГИДРАТИРОВАННОСТИ ТКАНИ ПУЛЬПОЗНОГО ЯДРА МЕЖПОЗВОНКОВОГО ДИСКА ЧЕЛОВЕКА МЕТОДОМ ИНФРАКРАСНОЙ СПЕКТРОСКОПИИ
ИЗУЧЕНИЕ СТЕПЕНИ ГИДРАТИРОВАННОСТИ ТКАНИ ПУЛЬПОЗНОГО ЯДРА МЕЖПОЗВОНКОВОГО ДИСКА ЧЕЛОВЕКА МЕТОДОМ ИНФРАКРАСНОЙ СПЕКТРОСКОПИИ
Аннотация
Цель исследования — оценить содержание свободной и связанной воды в ткани пульпозного ядра человека методом инфракрасной спектроскопии с Фурье-преобразованием. Исследовали 11 образцов ткани пульпозного ядра, удалённых при плановых пункционных декомпрессивных нуклеопластиках с одномоментным измерением внутридискового давления (нейрохирургическое отделение городской клинической больницы г. Кинешма). Инфракрасные спектры регистрировали на Фурье-спектрометре TENSOR-27 (Bruker Optics, Германия) и обрабатывали в программе OPUS‑6. Методом Фурье-деконволюции по Лоренцу выделяли полосы поглощения свободной и связанной воды, исключая вклад валентных колебаний N–H пептидных связей коллагена. Рассчитывали спектральный индекс онко/гидро (сО/Г) как отношение разности площадей пиков связанной и свободной воды к их сумме (диапазон от +1 — только связанная вода, до –1 — только свободная вода). Проводили сопоставление с модельным индексом, вычисленным по геометрической модели проницаемости пульпозного ядра. Повышение внутридискового давления сопровождалось батохромным сдвигом спектральных максимумов в области 3200–3650 см⁻¹ и увеличением доли связанной воды. Для образцов с внутридисковым давлением 40, 30 и 25 см вод. ст. спектральный индекс составил +0,37, +0,13 и –0,11 соответственно, что хорошо согласуется с расчётными значениями модели (+0,35; +0,11; –0,08). Метод Фурье-инфракрасной спектроскопии в сочетании с деконволюционным анализом позволяет количественно определять соотношение свободной и связанной воды в ткани пульпозного ядра, что может служить инструментом оценки состояния протеогликанового матрикса.
1. Введение
Межпозвонковый диск (МПД) человека анатомически делится на три составляющие части: внутренняя (центральная) часть — пульпозное ядро (ПЯ), наружный участок — фиброзное кольцо (ФК) и третья составляющая — тонкий слой гиалинового хряща (замыкательная пластинка), который сверху и снизу отделяет диск от тел смежных позвонков. В большинстве случаев болевой синдром в спине человека
обусловлен дегенерацией МПД. Считается, что дегенеративно-дистрофическому процессу в МПД предшествует повреждение, инициирующее каскад патологических реакций, сначала в гиалиновой пластинке с последующим распространением на ПЯ и ФК . Изменения матрикса в ПЯ включают в себя фрагментацию протеогликановых агрегатов (ПГА) с последующим снижением их концентрации. При этом уменьшается количество связанной воды и жизнеспособных хондроцитов , .По данным Глобального исследования бремени болезней 2021, в 2020 году боль в нижней части спины зарегистрирована у 619 млн человек, к 2050 году прогнозируется рост числа случаев до 843 млн, что делает данное состояние ведущей причиной инвалидности в мире
. У лиц старше 65 лет распространённость дегенеративных изменений межпозвонковых дисков превышает 90% . Ключевым патогенетическим звеном дегенерации является прогрессирующая потеря протеогликанов, приводящая к снижению содержания воды в пульпозном ядре и нарушению его биомеханических свойств , .Основным структурным компонентом ПЯ и ФК является фибриллярный белок коллаген, погружённый в гель ПГА. Сеть коллагена выполняет две основные функции: армирующую и связывающую ПГА. Основой ПГА является полимерная гиалуроновая кислота (ГК) — несульфатированный глюкозаминогликан, мономер которой образован D-глюкуроновой кислотой и N-ацетил-D-глюкозамином. Химическая природа веществ, входящих в протеогликаны МПД, обеспечивает отрицательный заряд их макромолекулам, притягивающий дипольные молекулы воды. Поэтому вода является одним из основных компонентов ПЯ МПД; её содержание варьирует от 77% у лиц старшей возрастной группы до 90 % у младенцев
. Связывание воды и набухание ПЯ определяют упруго-эластические свойства ткани. К факторам, вызывающим дегенерацию МПД, относят снижение проницаемости краевых гиалиновых пластинок, чрезмерные физические нагрузки и ряд других причин .Для детального анализа водных, в том числе и гетерогенных, систем давно используются методы ИК-спектроскопии. Полоса валентных колебаний ОН-групп находится в диапазоне волновых чисел 3100–3700 см⁻¹, однако её контур представляет собой широкую слабо разрешённую кривую. Для выделения индивидуальных компонент применяют Фурье-деконволюцию
. Подход с использованием этого метода показал, что структуру валентной полосы ОН можно описать несколькими спектральными компонентами: низкочастотный максимум 3000–3100 см⁻¹, максимумы около ~3200, ~3300 см⁻¹, самая интенсивная полоса ~3450 см⁻¹ и высокочастотные полосы ~3550 и ~3630 см⁻¹ . Высокочастотные полосы относятся к колебаниям ОН-групп с разорванной водородной связью; полоса ~3450 см⁻¹ — к ОН-группам с ослабленными водородными связями; низкочастотная полоса 3000–3100 см⁻¹ обусловлена ассоциатами с прочной тетраэдрической координацией, подобной льду . В этом же диапазоне находится полоса амида А коллагена (~3400 см⁻¹), относящаяся к валентному колебанию N–H связи, что существенно усложняет анализ водно-белковых систем . В литературе имеются примеры оценки содержания свободной и связанной воды в системе коллагеновых волокон с помощью ИК-спектроскопии, в том числе с использованием Фурье-преобразований . Современные спектроскопические подходы рассматриваются как перспективные для неинвазивной оценки состояния межпозвонковых дисков .Научная новизна настоящего исследования заключается в том, что впервые гидратацию пульпозного ядра оценивают количественно по ИК-спектрам с Фурье-деконволюцией, раздельно определяя свободную и связанную воду в операционном материале. Также впервые спектральный индекс сопоставлен с модельным индексом, рассчитанным по геометрической модели проницаемости пульпозного ядра.
Цель исследования — оценить содержание свободной и связанной воды в ткани пульпозного ядра человека методом ИК-спектроскопии с Фурье-преобразованием.
2. Методы и принципы исследования
Дизайн исследования: одномоментное (поперечное) обсервационное исследование образцов ткани, полученных интраоперационно.
Материалом служили ткани удалённого фрагмента ПЯ во время плановых операций пункционной декомпрессивной нуклеопластики МПД с одновременным измерением внутридискового давления (ВДД)
(нейрохирургическое отделение городской клинической больницы г. Кинешма). Получено 11 образцов; измеренные значения ВДД составили от 25 до 60 см вод. ст. Образцы выкладывали на KRS-стекло, хранили не более суток при температуре около 4 °С в герметичных контейнерах. Перед записью спектров образцы термостатировали при 22 °С.ИК-спектры регистрировали на Фурье-спектрометре TENSOR-27 (Bruker Optics, Германия) и обрабатывали программным обеспечением OPUS‑6. Для разделения вкладов свободной и связанной воды применяли Фурье-деконволюцию по модели Лоренца; полосу валентных колебаний N–H пептидных связей коллагена исключали из расчёта. Спектральный индекс онко/гидро (сО/Г) вычисляли как отношение разности площадей пиков связанной и свободной воды в диапазоне 3200–3650 см⁻¹ к их сумме; индекс принимает значения от +1 (только связанная вода) до –1 (только свободная вода). Для сопоставления использовали геометрическую модель проницаемости ПЯ, разработанную авторами
, , .3. Основные результаты
Упругость ткани ПЯ определяется присутствием воды, иммобилизованной комплексом коллагеновых фибрилл (КФ) и ПГА. Деструкция ПГА высвобождает воду и снижает упругость ядра. «Связанной» считают воду, удерживаемую силами межмолекулярного взаимодействия компонентами ПЯ; «свободной» — воду, находящуюся в пространстве между волокнами коллагена с растворёнными в ней продуктами распада ГК. Полосы поглощения этих двух типов воды в ИК-спектре различны, так как на них по-разному действуют ван-дер-ваальсовы, ионно-электростатические силы и водородные связи
, . Положения максимумов поглощения обоих типов воды отличаются от модельных, поскольку ионная сила этих водных систем различается .Полученные спектры (рис. 1) представляют собой типичные спектры коллагена
, в которых выделяются характерные для белка области. Амид А — широкая полоса поглощения с максимумом при 3295 см⁻¹, комбинированная, обусловленная колебательными модами воды и валентными колебаниями N–H пептидных связей коллагена.
ИК-спектр ткани пульпозного ядра
ВДД 50 см вод. ст.
Нормализованные путём приведения к базовой линии ИК-спектры образцов ткани ПЯ с внутридисковым давлением 25 (1) и 55 (2) см вод. ст
Фурье-деконволюция образцов ткани ПЯ с внутридисковым давлением 25 (1) и 55 (2) см вод. ст
В табл. 1 представлены зависимости ВДД от индекса онко/гидро, полученные по результатам ИК-спектроскопии и по геометрической модели проницаемости ПЯ. Модель подбирали по наиболее близким значениям ВДДм к экспериментальному ВДДэ.
Таблица 1 - Сопоставление спектрального и модельного индексов онко/гидро
ИК-спектроскопия Образцы ткани № 5, 6, 2 | Подобранная по проницаемости геометрическая модель | ||
ВДДэ, см вод. ст. | Индекс сО/Г | ВДДм, см вод.ст. | Индекс мО/Г |
40 | +0.37 | 36 | +0.35 |
30 | +0.13 | 26 | +0.11 |
25 | -0.11 | 22 | -0.08 |
Графическая зависимость ВДД от индекса онко/гидро
4. Обсуждение
Полученные данные согласуются с представлениями о том, что при дегенерации МПД происходит снижение рН в центре ПЯ до 6,4 вследствие лактат-ацидоза
. Уменьшение рН подавляет диссоциацию кислых групп ПГА, суммарный заряд падает, количество связанной воды уменьшается, а свободной — возрастает. В кислой среде ускоряется выработка гиалуронидазы , хотя её активность существенно не изменяется . Это ведёт к фрагментации ПГА и вымыванию глюкозаминогликанов. ПЯ дегидратируется, внутридисковое осмотическое давление падает, высвободившаяся вода фильтруется через коллагеновую сеть. Доказано, что при острых и хронических дегенеративных изменениях МПД содержание ГК в ПЯ существенно различается; концентрация ГК пропорциональна осмотическому давлению . Период полураспада ГК, протекающий под действием фермента гиалуронидазы, в организме человека составляет 2 суток, однако непрерывный синтез ГК приводит к обновлению её состава каждые 2–3 дня . Молекулярная масса ГК варьирует в широких пределах (от 5000 до 20 000 000 Да); например, средняя ММ макромолекул ГК в синовиальной жидкости человека составляет 3 140 000 Да . Волокна коллагена, входящие в состав ПЯ, толщиной 1,5 нм упакованы в фибриллы диаметром до 300 нм; в состав коллагена также входит связанная вода, играющая существенную роль в механизме образования коллагеновых фибрилл . Сформировавшиеся КФ практически не смачиваются свободной водой и не оказывают сопротивления движению жидкости вдоль волокна . МПД в поясничном отделе позвоночника способен выдерживать одноосное давление до 2,5 МПа .Сравнение спектрального и модельного индексов показывает хорошее согласие: для трёх образцов различия не превышают 0,05, что подтверждает адекватность как спектрального метода оценки гидратации, так и геометрической модели проницаемости ПЯ. Следует отметить, что значение ВДДм в модели отличается для разных значений времени падения измерительной капли (2, 3 и более секунд), что следует учитывать при сопоставлении
, , .В недавнем исследовании Vettese et al.
показано, что процессы децеллюляризации и стерилизации коллагеновых матриксов сопровождаются изменением их гидратации и структуры поперечных сшивок, что подчёркивает важность контроля содержания воды в тканях на основе коллагена. Это согласуется с нашими результатами о связи степени гидратации ПЯ с его функциональным состоянием.5. Заключение
В работе исследованы ИК-спектры образцов ткани ПЯ МПД с различной степенью деструкции ПГА. Образцы получены во время пункционной декомпрессивной нуклеопластики с одновременным измерением внутридискового давления (ВДДэ). Для количественной оценки использован безразмерный параметр — спектральный индекс онко/гидро (сО/Г), вычисляемый по результатам деконволюции и Фурье-анализа полосы поглощения 3200–3650 см⁻¹. Полученные значения сО/Г сопоставлены с модельным индексом мО/Г, рассчитанным по геометрической модели проницаемости ПЯ. Сравнение указывает на возможность применения предложенного спектрального подхода для оценки гидратированности пульпозного ядра и состояния его протеогликанового матрикса.