ИЗУЧЕНИЕ ЕСТЕСТВЕННО КИЛЛЕРНОЙ АКТИВНОСТИ МОНОНУКЛЕАРОВ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ IN VITRO ПОСЛЕ АКТИВАЦИИ МЕТАБОЛИЧЕСКИМИ КОРРЕКТОРАМИ

Холамов А.И.¹, Черношей Д.А.²

¹Курсант, 4-й курс, военно-медицинский факультет, Белорусский государственный медицинский университет; ²кандидат медицинских наук, доцент, кафедра микробиологии, вирусологии, иммунологии, Белорусский государственный медицинский университет

ИЗУЧЕНИЕ ЕСТЕСТВЕННО КИЛЛЕРНОЙ АКТИВНОСТИ МОНОНУКЛЕАРОВ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ IN VITRO ПОСЛЕ АКТИВАЦИИ МЕТАБОЛИЧЕСКИМИ КОРРЕКТОРАМИ

Аннотация

Цель настоящего исследования заключалась в изучении цитотоксических свойств естественно киллерной (ЕК) цитотоксической активности мононуклеаров периферической крови (МПК), после активации сукцинатом при остром воспалении in vitro. Основными задачами являлись отработка методики оценки функциональной активности и разработка модели функционирования МПК, а также оценка влияния сукцината как модификатора биологических реакций на их цитотоксичность. Результаты исследования могут быть в дальнейшем использованы для выбора тактики стимуляции МПК как in vitro, так в перспективе и in vivo, с помощью метаболических корректоров.

Ключевые слова: МПК, ЕК, МБР, сукцинат, цитотксичность.

Holamov A.I.², Chernoshei D.A.²

¹4^th year student, the Faculty of Military Medicine, Belarusian State Medical University; ²PhD in Medicine, assosiate professor, the Chair of Microbiology, Virusology, Immunology, Belarusian State Medical University

THE RESURCH OF NATURAL KILLER ACTIVITY OF PERIFERAL BLOOD MONONUCLEAR CELLS IN VITRO AFTER METABOLIC CORRECTORS’ ACTIVATION

Abstract

The aim of the research was to investigate the NK-like cytotoxic properties of the peripheral blood mononuclear cells (PBMC), after succinate treatment in acute inflammation condition in vitro. The main objectives are to develop the method of functional activity evaluation and development of the model of functioning of PBMC, as well as the succinate evaluation as a biological response modifier on their cytotoxicity. The results can be used while choosing the correct way of PBMC stimulation either in vitro or in vivo with the help of metabolic correctors.

Keywords: PBMC, NK, BRM, succinate, cytotoxicity.

Обзор литературы

Естественные киллеры (NK-клетки) по своей морфологии являются большими гранулярными лимфоцитами (15 мкм) [1]. Они отличаются от В- и Т-лимфоцитов наличием электронно-плотных гранул со специфическим содержимым – белки перфорины и гранзимы. Естественные киллеры участвуют в противоопухолевом и противовирусном иммунитете, элиминируют неправильно дифференцирующиеся бласты красного костного мозга и тимуса, запускают апоптоз в стареющих клетках организма, а также убивают любые лимфоциты, которые активируются пищевыми антигенами в печени и антигенами плода в матке, обуславливая толерантность к ним. На поверхности ЕК содержатся активирующие (KIR3D, CEACAM1, CD94/NKG2A и др.) и ингибирующие (NKp46, CD16, NKG2D и др.) рецепторы Ig-суперсемейства и суперсемейства С-лектин рецепторов. ЕК убивают клетки-мишени на основе лектинового распознавания или антителозависимой клеточной цитотоксичности при условии прекращения экспрессии ГКГ I (MHC I) на их поверхности. Цитотоксическое действие ЕК обусловлено перфоринзависимым механизмом и сходно с действием цитотоксических лимфоцитов, при котором происходит выделение гранул белка перфорина, встраивание их в плазмалемму мишени, а затем проникновение белков гранзимов, которые запускают цикл реакций каспаз, приводящих клетку к апоптозу. При соединении ЕК с Fc-фрагментом антител, прикрепленных к клеткам с чужеродными антигенами, развивается антителозависимая клеточная цитотоксичность и гибель мишени [2].

Материал и методы исследования

Материал: по 4 мл венозной крови, стабилизированной гепарином 20 ^ЕД/_мл, восьми доноров мужского пола в возрасте 20-21 год; липополисахарид Escherichia coli по 20 ^мкг/_мл; раствор фиколла (ρ=1,077 ^г/_см³), питательную среду RPMI-1640; препарат «Реамберин», содержащий сукцинат (1,5%-400 мл); 0,1% раствор трипанового синего; опухолевую линию клеток К-562; раствор Хенкса.

Методы исследования: культивирование, градиентное центрифугирование, микроскопия.

Цельную кровь, стабилизированную гепарином, культивировали с модификатором биологических реакций – сукцинатом – промежуточным метаболитом цикла трикарбоновых кислот. Стерильный раствор для инфузий препарата «Реамберин» добавляли в количестве 70 ^мкл/_мл. Пластиковая пробирка №1 (К) являлась контролем и содержал только кровь; пробирка №2 (ЛПС) – кровь и липополисахарид; пробирка №3 (С) – кровь и сукцинат; пробирка №4 (ЛПС+С) – кровь, липополисахарид и сукцинат. Культивирование проводили в течение 72 часов при температуре 36,6°С. После культивирования МПК выделяли стандартным методом градиентного центрифугирования с соблюдением всех этапов центрифугирования и отмывки. Далее клетки ресуспендировали в 500 мкл среды RPMI-1640. Опухолевые клетки линии К-562 пересевали дважды в неделю, отмывали полной питательной средой RPMI-1640. Определение жизнеспособности МПК и К-562 осуществляли путем исключения красителя трипанового синего (она составляла более 96%).

Краткосрочные 4-часовые цитотоксические тесты проводились в плоскодонном планшете Terasaki. Для оценки цитотоксичности МПК применялась методика, в которой проводилось разведение клеток-эффекторов ¹/₁, ¹/₁₀ и ¹/₁₀₀. Одновременно на планшете проводились 4 серии экспериментов по 3 разведения с 3 повторами трех репрезентативных доноров. До и после теста осуществлялся подсчет живых и мертвых клеток опухоли К-562 под световым микроскопом.

Результаты и их обсуждение

Была разработана модель функционирования естественных киллеров в условиях острого воспаления in vitro, произведена оценка влияния модификаторов биологических реакций на их цитотоксические свойства, приведенная модель функционирования ЕК работает и может быть использована при дальнейшем изучении их цитотоксичности и поиске метаболичесих активаторов их активности.

Таблица 1 – Процент гибели клеток К-562 при трех разведениях у трех репрезентативных доноров

	1/1			1/10			1/100
	№1	№2	№3	№1	№2	№3	№1	№2	№3
К	5,5%	5,2%	4,5%	9,6%	8,6%	8,9%	13,2%	12,8%	12,1%
ЛПС	7,2%	10,1%	6,7%	13,7%	13,3%	12,7%	15,8%	14,4%	14,8%
С	7,5%	4,9%	7,7%	11,4%	11,2%	10,7%	14,4%	15,3%	12,3%
ЛПС+С	12,2%	12,7%	8,4%	16,8%	15,2%	13,9%	20,6%	20,1%	23,9%

Выводы

• Липополисахарид способствует активации цитотоксичности естественных киллеров, сукцинат является метаболическим стимулятором их активности;
• Наиболее оптимальное соотношение числа клеток-мишеней и клеток-эффекторов – около 1/100;
• В экспериментах, в которых изучалось влияние одновременно сукцината и липополисахарида на цитотоксические свойства естественных киллеров, наблюдался наибольший процент гибель клеток опухоли К-562.