АНАЛИЗ РЕЗУЛЬТАТОВ ИЗУЧЕНИЯ АНАЛЬГЕТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ РАНЕЕ НЕИЗВЕСТНЫХ ПРОИЗВОДНЫХ ЦИАНОТИОАЦЕТАМИДА
АНАЛИЗ РЕЗУЛЬТАТОВ ИЗУЧЕНИЯ АНАЛЬГЕТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ РАНЕЕ НЕИЗВЕСТНЫХ ПРОИЗВОДНЫХ ЦИАНОТИОАЦЕТАМИДА
Аннотация
Цель исследований – анализ результатов изучения анальгетической активности новых производных цианотиоацетамида.
Материалы и методы. Экспериментальные исследования проводились на базе кафедры фундаментальной и клинической фармакологии ФГБОУ ВО «Луганский государственный медицинский университет имени Святителя Луки» Министерства Здравоохранения Российской Федерации. Исследования реализованы на 200 белых лабораторных крысах мужского пола массой 180...260 г. Эксперимент полностью соответствовал Приказу Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации от 23 августа 2010 г., №708н и Директивы Европейского союза по защите животных, используемых в научных целях (2010/63/EU). Определение обезболивающей активности проводилось в тесте горячей пластины (животных помещали на разогретую до 50...54ºС металлическую пластину, на которой животных окружали стеклянным цилиндром), а также в тесте тепловой иммерсии хвоста (хвост экспериментальной крысы погружали в горячую воду, нагретую в среднем до 52 ºС).
Результаты. В тесте горячей пластины образцами-лидерами стали d02-149 и d02-139 (цианотиоацетамид d02-139 эффективнее метамизола натрия в 2,45 раза, а d02-149 в 1,81 раза). В фармакологическом тесте тепловой иммерсии хвоста лучший результат по оказанию болеутоляющих свойств отразил образец с лабораторным шифром d02-122, эффективность которого выше, чем у метамизола натрия в 2,5 раза.
Заключение. Ранее неизвестные производные цианотиоацетамида обладают анальгетическими свойствами, что позволяет их рассматривать в качестве перспективных болеутоляющих препаратов.
1. Введение
Проблема купирования боли является актуальным направлением доклинической, клинической и экспериментальной медицины, являясь предметом фармакологических исследований . Поиск новых обезболивающих лекарственных средств является одной из важнейших задач медицины, которые по своей эффективности и безопасности превосходят аналоги, существующие на фармацевтическом рынке и имеющие обширный спектр нежелательных реакций и противопоказаний , , , . Перспективным доступным реагентом, зарекомендовавшим себя в качестве незаменимого строительного блока при получении обширного круга гетероциклических соединений, является цианотиоацетамид , , , . Виртуальный биоскрининг производных цианотиоацетамида подтверждает наличие огромного спектра биомишеней, что дает возможность использовать данные соединения в различных направлениях медицины. Таким образом, нами были отобраны с помощью программы SwissTargetPrediction восемь новых производных цианотиоацетамида, которые могут использоваться как потенциальные болеутоляющие средства .
2. Методы и принципы исследования
Экспериментальные исследования полностью соответствуют Приказу Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации от 23 августа 2010 г., №708н, а также Директивы Европейского союза по защите животных, используемых в научных целях (2010/63/EU). Изучение обезболивающей активности проведено на базе кафедры фундаментальной и клинической фармакологии ФГБОУ ВО ЛГМУ им. Свт. Луки Минздрава России. Эксперимент реализован на 200 белых лабораторных крысах-самцах, масса которых варьировалась от 180 до 260 г. Животные в каждом тесте были поделены на 10 групп (n = 10): контрольная, референтная и 8 экспериментальных групп. Контрольные группы животных не подвергались фармакокоррекции. Референтные группы получали за 1,5 часа до проведения исследования метамизол натрия (Анальгин ОАО «Фармстандарт») в дозе 7 мг/кг через желудочный зонд. Экспериментальным животным вводили внутрижелудочно за 1,5 часа до проведения фармакологических тестов в дозе 5 мг/кг образцы в виде суспензии с лабораторными шифрами: d02-149, d02-123, d02-122, d02-128, d02-141, d02-139, d02-168 и d02-133. Для определения наличия обезболивающих свойств новых синтезированных соединений, были выбраны два классических фармакологических теста: горячая пластина , и тепловая иммерсия хвоста .
Обработка и анализ полученных экспериментальных данных основывались на предположении о нормальности их распределения, которое проверялось по критерию Шапиро-Уилка (в онлайн-ресурсе Shapiro-Wilk Test Calculator — https://www.statskingdom.com/shapiro-wilk-test-calculator.html), так как в большинстве случаев количество замеров n < 50. Установлено, что данные почти во всех группах имеют нормальное распределение или близкое к нему. Для данных групп также определялись: среднее арифметическое a; дисперсия значений s2 вокруг среднего арифметического; среднеквадратическое отклонение sв онлайн-ресурсе (Среднее арифметическое, дисперсия, вариация – https://allcalc.ru/node/89); разность, δ (в см и %) отдельных групп, а также средние значения разности групп сравнения и исследуемых образцов. В связи с индивидуальными характеристиками экспериментальных животных, однородность полученных экспериментальных данных оценивалась коэффициентом вариации V в указанном онлайн-ресурсе. Считалось, что, если значение коэффициента вариации менее 33%, то совокупность данных является однородной, если более 33%, то неоднородной.
Если коэффициент вариации превышал 33%, то это говорило о необходимости исключения определённых значений. Оценка значений исключаемых данных и сглаживание ряда данных производились на основе 95%-го доверительного интервала, размер которого по опытным группам определялся в зависимости от значений статистических показателей в онлайн-калькуляторе: «Изучай электронику» (https://learningaboutelectronics.com).
Различия между группами оценивались в сравнении с контрольной группой методом параметрической статистики по критерию Стьюдента, с использованием стандартных программных методов описательной статистики.
Также в сравнение групп данных экспериментальных исследований производилось множественным непараметрическим методом по критерию Крускала-Уоллиса с апостериорным тестом Данна и поправкой Бонферрони в онлайн-ресурс KruskalWallis Test Calculator (https://www.statskingdom.com/kruskal-wallis-calculator.html).
3. Основные результаты
Итоговые результаты исследования обезболивающей активности в тесте горячей пластины новых производных цианотиоацетамида представлены в табл. 1.
Таблица 1 - Результаты экспериментальных исследований болеутоляющей активности в тесте горячей пластины новых производных цианотиоацетамида
Опытная группа | Измеренное в экспериментах время латентного периода до начала прыжков с поверхности горячей пластины а, сек | Статистические характеристики: Среднее время латентного периода до начала прыжков с поверхности горячей пластины аср, сек; дисперсия s2; среднеквадратическое отклонение s; коэффициент вариации V, % | ||
Доверительный интервал | Исключаемые значения | Полученные по данным экспериментов | Полученные после сглаживания данных экспериментов | |
Референтная (Анальгин ОАО «Фармстан-дарт», 7 мг/кг) Х1 | 21, 27, 25, 18, 60, 40, 25, 37, 41, 35 | aср = 32,9 с; s2 = 154,9; s = 12,4; V = 37,8% | aср = 32,8 с; s2 = 49,0; s = 7,0; V = 21,4% | |
24,0 < aср < 41,8 | 21, 18, 60 | |||
*p = 0,31 > α = 0,05 | ||||
Контрольная Х2 | 22, 17, 18, 20, 10, 17, 17, 18, 15, 14 | aср = 16,8 с; s2 = 26,2; s = 5,1; V = 31,5% | aср = 17,0 с; s2 = 3,2; s = 1,8; V = 10,9% | |
12,6 < aср < 19,8 | 10, 22 | |||
*p = 0,71 > α = 0,05 | ||||
1. d02-128 (5 мг/кг) Х3 | 13, 20, 21, 17, 14, 18, 9, 11, 10, 19 | aср = 15,2 с; s2 = 17,2; s = 4,2; V = 27,6% | aср = 15,3 с; s2 = 9,6; s = 3,1; V = 20,5% | |
10,9 < aср < 19,1 | 20, 21, 9, 10 | |||
*p = 0,45 > α = 0,05 | ||||
2. d02-141 (5 мг/кг) Х4 | 26, 35, 27, 25, 32, 28, 27, 30, 29, 34 | aср = 29,3 с; s2 = 10,4; s = 3,2; V = 11,0% | aср = 28,8 с; s2 = 3,8; s = 1,9; V = 6,7% | |
27,0 < aср < 32,1 | 26, 35, 25, 34 | |||
*p = 0,49 > α = 0,05 | ||||
3. d02-122 (5 мг/кг) Х5 | 8, 30, 34, 93, 63, 44, 38, 53, 48, 36 | aср = 44,7 с; s2 = 454,6; s = 21,3; V = 47,7% | aср = 40,4 с; s2 = 67,3; s = 8,2; V = 20,3% | |
29,5 < aср < 60,0 | 8, 93, 63 | |||
*p = 0,60 > α = 0,05 | ||||
4. d02-133 (5 мг/кг) Х6 | 33, 35, 64, 70, 48, 36, 51, 62, 36, 49 | aср = 48,4 с; s2 = 162,6; s = 12,8; V = 26,3% | aср = 52,5 с; s2 = 41,7; s = 6,4; V = 12,3% | |
39,2 < aср < 62,1 | 33, 35, 64, 70, 36, 36 | |||
*p = 0,21 > α = 0,05 | ||||
5. d02-123 (5 мг/кг) Х7 | 61, 93, 38, 42, 50, 36, 47, 42, 53, 32 | aср = 49,4 с; s2 = 277,6; s = 16,7; V = 33,7% | aср = 47,6 с; s2 = 61,6; s = 7,8; V = 16,5% | |
37,4 < aср < 61,3 | 93, 36, 32 | |||
*p = 0,88 > α = 0,05 | ||||
6. d02-168 (5 мг/кг) Х8 | 35, 42, 63, 63, 38, 44, 57, 45, 61, 52 | aср = 50,0 с; s2 = 100,6; s = 10,0; V = 20,1% | aср = 48,0 с; s2 = 39,5; s = 6,3; V = 13,1% | |
41,9 < aср < 57,2 | 35, 63, 63, 38, 61 | |||
*p = 0,28 > α = 0,05 | ||||
7. d02-149 (5 мг/кг) Х9 | 69, 65, 50, 78, 64, 53, 61, 58, 51, 48 | aср = 59,7 с; s2 = 82,4; s = 9,1; V = 15,2% | aср = 60,2 с; s2 = 23,7; s = 4,9; V = 8,1% | |
52,9 < aср < 66,2 | 69, 50, 78, 51, 48 | |||
*p = 0,68 > α = 0,05 | ||||
8. d02-139 (5 мг/кг) Х10 | 95, 96, 90, 78, 89, 61, 58, 74, 98, 68 | aср= 80,7 с; s2 = 201,0; s = 14,2; V = 17,6% | aср= 79,8 с; s2 = 91,2; s = 9,5; V = 12,0% | |
70,5 < aср < 90,9 | 95, 96, 61, 58, 98 | |||
*p = 0,25 > α = 0,05 | ||||
Примечание: p-критерий, показывающий, что полученные данные имеют нормальное распределение, если значение p больше принятого уровня значимости α = 0,05
Множественное сравнение данных экспериментальных исследований обезболивающей активности в тесте горячей пластины по критерию Крускала-Уоллиса представлены в табл. 2.
Таблица 2 - Результаты множественного сравнения данных экспериментальных исследований болеутоляющей активности в тесте горячей пластины по критерию Крускала-Уоллиса
Пара | х1-х2 | х1-х3 | х1-х4 | х1-х5 | х1-х6 | х1-х7 | х1-х8 | х1-х9 |
р | 0,078 | 0,065 | 0,690 | 0,343 | 0,050 | 0,089 | 0,103 | 0,007 |
Пара | х1-х10 | х2-х3 | х2-х4 | х2-х5 | х2-х6 | х2-х7 | х2-х8 | х2-х9 |
р | 0,0009 | 0,831 | 0,177 | 0,006 | 0,0006 | 0,0004 | 0,001 | 0,00001 |
Пара | х2-х10 | х3-х4 | х3-х5 | х3-х6 | х3-х7 | х3-х8 | х3-х9 | х3-х10 |
р | 5,6e-7 | 0,143 | 0,006 | 0,0006 | 0,0005 | 0,001 | 1,7e-5 | 9,5e-7 |
Пара | х4-х5 | х4-х6 | х4-х7 | х4-х8 | х4-х9 | х4-х10 | х5-х6 | х5-х7 |
р | 0,178 | 0,024 | 0,036 | 0,046 | 0,002 | 0,0002 | 0,269 | 0,451 |
Пара | х5-х8 | х5-х9 | х5-х10 | х6-х7 | х6-х8 | х6-х9 | х6-х10 | х7-х8 |
р | 0,445 | 0,068 | 0,01439 | 0,643 | 0,713 | 0,578 | 0,270 | 0,940 |
Пара | х7-х9 | х7-х10 | х8-х9 | х8-х10 | х9-х10 | - | - | - |
р | 0,257 | 0,078 | 0,327 | 0,119 | 0,562 | - | - | - |
По результатам табл. 2 установлено, что апостериорный тест Данна с использованием поправки Бонферрони (0,0011) показал, что средние ранги следующих пар различаются (где p<α): х1-х9; x1-x10; х2-х5; x2-x6; x2-x7; x2-x8; x2-x9; x2-x10; х3-х5; x3-x6; x3-x7; х3-х8; х3-х9; х3-х10; х4-х10; х4-х6; х4-х7; х4-х8; х4-х9; х4-х10; х5-х10.
В сравнении с референтной группой наибольшую обезболивающую активность показывают образцы х9 (d02-149) и x10 (d02-139). В контрольной группе среднее значения времени нахождения экспериментальных животных на горячей платине, покрытой цилиндром, составило 17,0 сек. Предварительное введение через желудочный зонд метамизола натрия отразило характерное для анальгетического лекарственного средства увеличение латентного периода до возникновения ноцицептивного импульса в 1,95 раза (составляет 32,9 сек, после сглаживания данных этот показатель равняется 32,8 сек).
В сравнении с референтной группой, получавшей метамизол натрия, наибольшую обезболивающую активность показывают образцы х9 (d02-149) и x10 (d02-139). Максимально выраженная обезболивающая активность данных соединений обусловлена увеличением латентного периода до начала облизывания задних лап у образца d02-149 в 3,7 раза и соединения с шифром d02-139 в 5,0 раза.
Результаты исследований обезболивающей активности новых синтезированных производных цианотиоацетамида в тесте иммерсии хвоста представлены в табл. 3.
Таблица 3 - Результаты обезболивающей активности в тесте тепловой иммерсии хвоста синтезированных производных цианотиоацетамида
Опытная группа | Измеренное в экспериментах время латентного периода тепловой иммерсии хвоста а, сек | Статистические характеристики: Среднее время латентного периода тепловой иммерсии хвоста аср, сек; дисперсия s2; среднеквадратическое отклонение s; коэффициент вариации V, % | ||
Доверительный интервал | Исключаемые значения | Полученные по данным экспериментов | Полученные после сглаживания данных экспериментов | |
1. Референтная (Анальгин ОАО «Фармстан-дарт», 7 мг/кг) Х1 | 19, 15, 19, 14, 18, 14, 14, 15, 14, 17 | aср = 15,9 с; s2 = 4,5; s = 2,1; V = 13,4% | aср = 14,7 с; s2 = 1,2; s = 1,1; V = 7,8% | |
13,8 < aср < 17,4 | 19, 19, 18 | |||
*p = 0,01 < α = 0,05 | ||||
2. Контрольная Х2 | 12, 11, 12, 8, 8, 9, 9, 10, 12, 11 | aср = 10,2 с; s2 = 2,6; s = 1,6; V = 15,9% | aср = 10,0 с; s2 = 1,0; s = 1,0; V = 10,0% | |
8,9 < aср < 11,4 | 12, 12, 8, 8, 12 | |||
*p = 0,11 > α = 0,05 | ||||
3. d02-133 (5 мг/кг) Х3 | 16, 5, 5, 10, 18, 22, 7, 18, 15, 16 | aср = 13,2 с; s2 = 36,2; s = 6,0; V = 45,6% | aср = 12,8 с; s2 = 16,7; s = 4,1; V = 31,9% | |
8,9 < aср < 17,5 | 5, 5, 18, 22, 18 | |||
*p = 0,25 > α = 0,05 | ||||
4. d02-128 (5 мг/кг) Х4 | 5, 5, 17, 10, 20, 17, 15, 9, 19, 19 | aср = 13,6 с; s2 = 34,04; s = 5,83; V = 42,9% | aср = 13,6 с; s2 = 14,8; s = 3,8; V = 28,3% | |
8,8 < aср < 17,8 | 5, 5, 20, 19, 19 | |||
*p = 0,17 > α = 0,05 | ||||
5. d02-139 (5 мг/кг) Х5 | 15, 15, 11, 8, 23, 17, 13, 10, 17, 20 | aср = 15,2; s2 = 22,2; s = 4,7; V = 31,0% | aср = 14,7; s2 = 5,5; s = 2,3; V = 15,9% | |
10,8 < aср < 18,6 | 8, 23, 10, 20 | |||
*p = 0,99 > α = 0,05 | ||||
6. d02-149 (5 мг/кг) Х6 | 19, 34, 13, 12, 12, 10, 14, 22, 12, 15 | aср = 16,3 с; s2 = 51,8; s = 7,2; V = 44,2% | aср = 13,9 с; s2 = 6,5; s = 2,5; V = 18,4% | |
11,2 < aср < 21,4 | 34, 10, 22 | |||
*p = 0,04 < α = 0,05 | ||||
7. d02-123 (5 мг/кг) Х7 | 19, 15, 19, 27, 30, 19, 25, 15, 22, 28 | aср = 21,9 с; s2 = 28,8; s = 5,4; V = 24,5% | aср = 20,8 с; s2 = 7,2; s = 2,7; V = 12,9% | |
18,0 < aср < 25,7 | 15, 27, 30, 15, 28 | |||
*p = 0,39 > α = 0,05 | ||||
8. d02-168 (5 мг/кг) Х8 | 20, 36, 19, 20, 13, 22, 31, 20, 32, 17 | aср = 23,0 с; s2 = 54,9; s = 7,4; V = 32,2% | aср = 20,2 с; s2 = 1,2; s = 1,1; V = 5,4% | |
17,7 < aср < 28,3 | 36, 13, 31, 32, 17 | |||
*p = 0,16 > α = 0,05 | ||||
9. d02-141 (5 мг/кг) Х9 | 4, 35, 24, 24, 45, 26, 32, 19, 15, 20 | aср = 24,4 с; s2 = 127,8; s = 11,3; V = 46,3% | aср = 24,2 с; s2 = 21,8; s = 4,7; V = 19,3% | |
16,3 < aср < 32,5 | 4, 35, 45, 15 | |||
*p = 0,99 > α = 0,05 | ||||
10. d02-122 (5 мг/кг) Х10 | 26, 29, 37, 19, 51, 50, 12, 28, 116, 21 | aср = 38,9 с; s2 = 893,4; s = 29,9; V = 76,8% | aср = 36,8 с; s2 = 126,2; s = 11,2; V = 30,5% | |
21,6 < aср < 56,2 | 19, 12, 116, 21 | |||
*p = 0,14 > α = 0,05 | ||||
Примечание: p-критерий, показывающий, что полученные данные имеют нормальное распределение, если значение p больше принятого уровня значимости α = 0,05
Множественное сравнение данных экспериментальных исследований обезболивающей активности в тесте тепловой иммерсии хвоста по критерию Крускала-Уоллиса представлено в табл. 4.
Таблица 4 - Результаты множественного сравнения данных экспериментальных исследований обезболивающей активности в тесте тепловой иммерсии хвоста по критерию Крускала-Уоллиса
Пара | х1-х2 | х1-х3 | х1-х4 | х1-х5 | х1-х6 | х1-х7 | х1-х8 | х1-х9 |
р | 0,105 | 0,671 | 0,811 | 0,925 | 0,722 | 0,042 | 0,035 | 0,007 |
Пара | х1-х10 | х2-х3 | х2-х4 | х2-х5 | х2-х6 | х2-х7 | х2-х8 | х2-х9 |
р | 0,0005 | 0,268 | 0,201 | 0,098 | 0,195 | 0,0007 | 0,0006 | 5,2e-5 |
Пара | х2-х10 | х3-х4 | х3-х5 | х3-х6 | х3-х7 | х3-х8 | х3-х9 | х3-х10 |
р | 1,8e-6 | 0,864 | 0,619 | 0,920 | 0,023 | 0,019 | 0,004 | 0,0003 |
Пара | х4-х5 | х4-х6 | х4-х7 | х4-х8 | х4-х9 | х4-х10 | х5-х6 | х5-х7 |
р | 0,751 | 0,932 | 0,036 | 0,030 | 0,007 | 0,0006 | 0,663 | 0,061 |
Пара | х5-х8 | х5-х9 | х5-х10 | х6-х7 | х6-х8 | х6-х9 | х6-х10 | х7-х8 |
р | 0,052 | 0,012 | 0,001 | 0,018 | 0,015 | 0,002 | 0,0001 | 0,947 |
Пара | х7-х9 | х7-х10 | х8-х9 | х8-х10 | х9-х10 | - | - | - |
р | 0,605 | 0,212 | 0,655 | 0,238 | 0,443 | - | - | - |
По результатам табл. 4. установлено, что апостериорный тест Данна с использованием поправки Бонферрони (0,0011) показал, что средние ранги следующих пар различаются (где p<α): х1-х7; х1-х8; х1-х9; x1-x10; x2-x7; x2-x8; x2-x9; x2-x10; х3-х7; х3-х8; х3-х9; x3-x10; х4-х7; х4-х8; х4-х9; x4-x10; х5-х9; x5-x10; х6-х7; х6-х8; х6-х9; x6-x10.
В сравнении с референтной группой наибольшую обезболивающую активность имеет производное цианотиоацетамида с шифром d02-122.
В контрольной группе среднее значения времени отдергивания хвоста составляет 10,0 с. У крыс референтной группы, получавших с целью фармакокоррекции моделируемого болевого синдрома метамизол натрия, в дозе 7 мг/кг, данное значение увеличилось до 15,9 сек (после сглаживания данных показатель приравнивается к 14,7 сек). В сравнении с референтной группой наибольшую болеутоляющую активность показывает образец х10 (d02-122). Данное гетероциклическое соединение увеличивает латентный период времени отдергивания хвоста в 2,5 раза в сравнении с группой животных, получавших уже известный анальгетик – Анальгин ОАО «Фармстандарт».
На протяжении двух экспериментов нами наблюдалась адекватная поведенческая активность, хороший аппетит в динамике у лабораторных животных всех экспериментальных групп.
4. Заключение
Три из восьми новых производных цианотиоацетамида в дозе 5 мг/кг с лабораторными шифрами d02-139 (5-cyano-N-(2,4-dichlorophenyl)-4-(2-furyl)-6-({2-[(4-methoxyphenyl)amino]-2-oxoethyl}thio)-2-methyl-1,4-dihydropyridine-3-carboxamide), d02-149 (6-[(2-anilino-2-oxoethyl)thio]-5-cyano-N-(2,4-dichlorophenyl)-4-(2-furyl)-2-methyl-1,4-dihydropyridine-3-carboxamide) и d02-122 (5-cyano-N-(2,4-dichlorophenyl)-4-(2-furyl)-2-methyl-6-[(2-oxo-2-{[2-(trifluoromethyl)phenyl]amino}ethyl)thio]-1,4-dihydropyridine-3-carboxamide) являются лидерами в фармакологических тестах по изучению анальгетической активности (горячая пластина и тепловая иммерсия хвоста), поскольку эффективнее в 2-3 раза эталонного в плане болеутоляющих свойств метамизола натрия.