Морфологические аспекты регенерации кожной раны у крыс при применении отдельного узлового и непрерывного подкожно-внутрикожного шва

Закрытие кожи является неотъемлемой частью ушивания послеоперационной раны после лапаротомии [1]. Причем тип закрытия кожи связан с возможным осложнением течения раневого регенераторного процесса [2]. Тип закрытия кожи влияет на заживление ран и косметический результат [3]. Существует множество методов ушивания кожи после лапаротомии, однако окончательный выбор в пользу какой-либо методики не совершен, и мы полностью согласны с утверждением [4] что на сегодняшний день оптимальный выбор закрытия кожи после лапаротомного разреза пока не определен. Поэтому существующая неудовлетворенность результатами наложения кожных швов у пациентов, перенесших лапаротомию, диктует необходимость дальнейшего поиска шовной техники, создающей оптимальные условия для заживления раны.

Разработанная нами (Патент РФ на изобретение №2631740) [5]  методика формирования непрерывного подкожно-внутрикожного шва требует всестороннего, в том числе и морфологического изучения и сравнения с часто применяющимися способами ушивания послеоперационной раны.

Цель данной работы - в эксперименте выявить особенности процесса заживления лапаротомной кожной раны, ушитой непрерывным подкожно-внутрикожным швом и сравнить полученные результаты с результатами закрытия лапаротомной кожной раны отдельными узловыми швами.

Дизайн эксперимента. Эксперимент выполнен на годовалых самках крыс чистой линии Wistar, средней массы 150-200г. Всем животным в стерильных условиях, после наркоза инъекцией препарата «Рометар», выполнялась срединная лапаротомия с последующим ушиванием послеоперационной раны. В зависимости от методики ушивания поверхностных слоев (кожи) лапаротомной раны экспериментальные животные распределялись на две группы, по двенадцать особей в каждой. Первая группа состояла из крыс, у которых кожа была ушита викрилом отдельными узловыми швами. Во вторую группу входили крысы, которым для ушивания поверхностных слоев лапаротомной раны применялся непрерывный подкожно-внутрикожный шов по предложенной нами методике [5]. Животные содержались и выводились из эксперимента согласно правилам лабораторной практики Российской федерации (приказ МЗ РФ №267 от 2003 года) и в соответствии с принципами, изложенными в Конвенции по защите позвоночных, используемых для экспериментальных и других целей (г. Страсбург, Франция,1986). На эту экспериментальную работу получено разрешение локального Этического комитета РостГМУ №12/19 от 27.06.2019г.

Объектом исследования служили слои кожи вокруг швов крыс, взятые на 3,5,30-е сутки после ушивания раны. Течение репаративных процессов в коже оценивали, используя гистологические срезы, изготовленные по стандартным методикам и окрашенные гематоксилином по Карацци  и докрашенные эозином просматривались в светооптический микроскоп  ZEISS Axio Imager Германия. Использован также метод электронной микроскопии (низковакуумный СЭМ ЕМ6900 LV) Германия, для которого материал забирался и фиксировался в глутаральдегиде с последующей фиксацией в осмиевой кислоте. Морфометрические исследования включали: вычисление толщины эпидермиса; вычислялось количество жизнеспособных волосяных фолликулов и сальных желез в дерме; оценивалась интенсивность васкуляризации сосочкового и сетчатого слоев, а также выраженность коллагена в новообразованной плотной волокнистой соединительной ткани рубца. После ушивания экспериментальной раны, используя маркеры для иммуногистохической реакции: Ki-67, p-53 DO7, СD-34 фирмы SIGMA США, на 5-е и 30-е сутки оценивались интенсивность апоптотической гибели, пролиферативная активность, степень васкуляризации при регенерации слоев кожи в обеих экспериментальных группах. Полученные при подсчетах данные подвергались проверке на достоверность с использованием критерия Мани-Уитни.

Признаков перитонита и гибели, животных после операции не было. Осложнений в послеоперационном периоде, которые можно было бы, связать с выполнением предложенного способа мы не наблюдали. Проведенное исследование через 3-е суток после ушивания лапаротомной раны установило, что наблюдаемые морфологические проявления воспалительного и репаративного процессов в коже схожи в обеих экспериментальных группах. Однако следует отметить, что в зависимости от способа наложения шва, уже четко прослеживается различие в интенсивности проявлений и объемов морфологического восстановления в кожных слоях. На всем протяжении раневого канала, наряду с жизнеспособными тканями, содержится значительное количество некротизированных тканевых участков, окруженных вновь сформированным межклеточным веществом, содержащим кровеносные микрососуды.  Во всех слоях кожной раны, и прежде всего в местах прохождения лигатур, наблюдается выраженная лейкоцитарная инфильтрация, преимущественно нейтрофильного характера. Отчетливо заметен межтканевой отёк. Описанные изменения ярче проявляются у животных, перенесших наложение отдельных узловых швов. В дерме видны вновь образующиеся анастомозирующие микрососуды. Причем, эти изменения интенсивнее представлены у животных, составляющих вторую группу. Кроме того, у животных этой же группы, наблюдается менее выраженные участки некроза, что свидетельствует о более динамично протекающем фагоцитозе детрита.

Над соединительной тканью в ране на 5-е сутки эксперимента определяется организованный эпидермис. Несмотря на воссоздание первоначальной структуры, толщина надкожицы и её рогового слоя, к этому сроку эксперимента, продолжает превышать нормальные показатели, причем особенно выражена она у животных, где рана ушивалась отдельными узловыми швами. Морфологическое исследование в обеих изучаемых группах через пять суток эксперимента обнаружило молодую обильно васкуляризированную соединительную ткань ширина которой у крыс в 1-й группе – 2,3± 0,3 мм., что статистически значимо больше (р<0,5 при использовании критерия Манна-Уитни) в группе с использованием непрерывного подкожно-внутрикожного шва (1,2± 0,3 мм).  В ране этой же группы отмечаются более интенсивное восстановление структуры кожных слоев и сосудов микроциркуляторного русла.

Насыщенное появление маркера Ki-67 в кератиноцитах базального слоя указывает на функциональную активность эпидермиса. Окружающие формирующийся рубец и полноценные по гистологическим критериям волосяные луковицы у крыс первой группы были обнаружены лишь в редких случаях. При этом у животных второй группы волосяные фолликулы нормального морфологического строения при исследовании раны встречались гораздо чаще, достигая в среднем концентрации 43±2 штуки в 1/мм2.

Сходная картина наблюдалась и при изучении сальных желез. У животных второй группы по краям раны, с помощью прицельной электронной микроскопии, обнаруживались неповрежденные сальные железы. Тогда как в первой группе редко встречавшиеся сальные железы, как правило, были окружены различными видами гранулярных лейкоцитов и имели частично разрушенные секреторные отделы. В области рубца, при участии коллагеновых волокон, наблюдается образование коллагеновых конгломератов и фибриллярных пластин. Вместе с тем в сетчатом слое обнаруженные коллагеновые и, представленные в небольшом количестве, эластические волокна расположены хаотично. Неупорядоченное расположение соединительнотканных волокон более выражено при соединении кожных краёв отдельными узловыми швами. Так же в этой группе ещё остаются признаки межтканевого отёка и нарушения целостности основного компонента межклеточного вещества. В то же время у крыс второй группы очевидны проявления динамичного фибриллогенеза и более строгого упорядочения коллагеновых волокон.

Проведенное спустя пять суток после ушивания ран морфометрическое исследование установило, что средняя величина относительного объема коллагена в рубце у животных первой группы достигает 556±0,9 мкг/мл, что статистически достоверно (р<0,5 при использовании критерия Манна-Уитни) больше чем во второй группе, где этот показатель  равен 301±1,12 мкг/мл.

В сшитых краях концентрация сосудов в собственно коже статически значимо (р<0,5 при использовании критерия Манна-Уитни) преобладает во второй группе (45±0,04 %) по сравнению с аналогичным показателем определяемым во второй группе (38±0,07).

Через 30 суток после ушивания раны высота вновь сформированного эпидермиса превышала показатели нормы, при этом высокодостоверно (р<0,005 при применении критерия Манна-Уитни) была больше при использовании отдельного узлового шва (8,2±1,14 мкм), чем в группе крыс где применялась новая методика (4,1±3,18 мкм.). При нашей методике наложения шва количество волосяных фолликулов (64±0,93 в 1мм3) немного не достигало нормальных показателей, статистически недостоверно превышая аналогичные показатели у животных первой группы (57±1,2 в 1мм3). В дерме околорубцовой зоны у крыс второй группы обнаруживались единичные сальные железы. Тогда как в первой группе железы не были визуализированы. Объём коллагена в рубце составил в первой группе 531 мкг/мл., а во второй группе 370±0,06 мкг/мл. Разница этих показателей при использовании непараметрического критерия Манна-Уитни статистически достоверна.

Исследование проявлений иммуногистохимических маркеров к пятым суткам заживления позволяет утверждать, что пролиферация (оцениваемая по маркеру Ki-67) в кератиноцитах эпидермиса и клеток собственно кожи зоны регенерации раны сильнее у крыс второй группы. Развитие сосудов микроциркуляторного русла идет активнее также во второй группе, о чем свидетельствует высокий показатель СD-34. Апоптоз клеток дермы (p-53 DO7), был характерен, но статистически не разнился для обеих групп.

В конце нашего экспериментального срока наблюдений у всех исследуемых животных реакция на иммуногистохимические маркеры апоптоза клеток дермы, кератиноцитов волосяных луковиц в регенерировавшей ране была отрицательной. А интенсивность окрашивания тканей при обработке маркерами Ki-67 и СD-34 соответствовала морфологической картине физиологической регенерации слоев кожи.

Предыдущее изучение восстановления кожи после наложения непрерывного подкожно-внутрикожного шва выявило отличия при применении методики прерывистого наложения швов [6], [7], [8].   В нынешнем исследовании установлено, что процесс регенерации слоев кожи и её производных разнится в зависимости от выполненной методики формирования швов. В наблюдениях, где ушивание раны выполнялось отдельными узловыми швами, на протяжении первых пяти суток эксперимента отмечались резко выраженные воспалительные изменения, сопровождаемые нейтрофильной инфильтрацией, межтканевым отеком и значительными некротическими участками. Не все структуры кожи восстанавливаются к концу наблюдений, что проявляется в формировании рубца на месте линейного хирургического разреза. Подобный исход является характерным для репаративной регенерации кожи [9], [10].  Однако большая ширина рубца, повышенное содержание в нем коллагена, значительная высота вновь сформированного эпидермиса, отсутствие вокруг рубца сальных желез, недостаточное восстановление волосяных луковиц, малое число сосудов микроциркуляции свидетельствуют о грубых морфологических изменениях, сопровождающих течение репаративного процесса в коже животных первой экспериментальной группы.

Во второй экспериментальной группе на начальных сроках заживления признаки воспаления носят умеренный характер. В лейкоцитарной инфильтрации не выявлялись нейтрофилы. Наблюдался активный фагоцитоз фрагментарных масс детрита. В конечные сроки эксперимента после наложения непрерывного подкожно-внутрикожного шва морфологические аспекты регенерации кожной раны имеют определенные особенности. Рубец на месте раны узкий, более организованный. Высота эпидермиса над раной приближается к норме, волосяные фолликулы практически сохранены, в около раневой зоне регистрируются сальные железы, а вновь образованные капилляры, венулы и артериолы имеют признаки функциональной активности.  По нашему мнению, вышеперечисленные структурные преимущества связаны со способом наложения предлагаемого нами варианта непрерывного шва, обеспечивающего маловыраженный тканевой валик, надежный гемостаз, плотное прилегание и точное сопоставление сшиваемых слоев кожи.

Выявленные морфологические особенности регенерации лапаротомной кожной раны указывают на более благоприятное течение репаративного процесса при применении непрерывного подкожно-внутрикожного шва по сравнению с использованием отдельного узлового шва.