ОБНАРУЖЕНИЕ И КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ КУМАРИНОВ В РАСТИТЕЛЬНОМ СЫРЬЕ ЛЮБИСТОКА ЛЕКАРСТВЕННОГО, ПРОИЗРАСТАЮЩЕГО В АРХАНГЕЛЬСКОЙ ОБЛАСТИ

ОБНАРУЖЕНИЕ И КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ КУМАРИНОВ В РАСТИТЕЛЬНОМ СЫРЬЕ ЛЮБИСТОКА ЛЕКАРСТВЕННОГО, ПРОИЗРАСТАЮЩЕГО В АРХАНГЕЛЬСКОЙ ОБЛАСТИ

Научная статья

Кубасова Е.Д.^1, *, Корельская Г.В.², Суханов А.Е.³, Крылов И.А.⁴, Кубасов Р.В.⁵

¹ ORCID: 0000-0001-9683-7814;

² ORCID: 0000-0003-4236-1966;

³ ORCID: 0000-0002-6214-307Х;

⁴ ORCID: 0000-0003-3042-4229;

⁵ ORCID: 0000-0003-1698-6479;

^1-5 Северный государственный медицинский университет, Архангельск, Россия

* Корреспондирующий автор (lapkino[at]mail.ru)

Аннотация

Актуальность: биологически активные субстанции, определяемые в лекарственном растении Любисток лекарственный (Levisticum officinale W.D.J. Koch), разнообразны. Среди них значительную заинтересованность для фармации имеют кумарины и их производные, поскольку имеют разносторонний лекарственный эффект. Цель исследования – обнаружение и количественное определение кумаринов в Любистоке лекарственном, произрастающем в Архангельской области, для возможного определения сырья этого растения в качестве лекарственного. Материалы и методы: определено наличие и количественное содержание кумаринов в сырье Любистока лекарственного, произрастающего на территории Архангельской области с помощью спектрофотометрического метода химического анализа. Результаты исследования: качественными пробами (лактонная, реакция с диазореактивом в щелочной среде) подтверждено наличие в корнях изучаемого растения кумаринов; количественно определено содержание кумаринов относительно общей сухой массы сырья, оно составило 0,213±0,009% (95% доверительный интервал = 0,188-0,238). Полученные результаты согласуются с данными других исследователей, средняя относительная доля кумаринов по отношению к общей массе сухого растения соотносится к среднестатистическим научным результатам (входит в интервал 0,19 до 0,52%).

Ключевые слова: Любисток лекарственный, кумарины.

DETECTION AND QUANTITATIVE DETERMINATION OF COUMARINS IN THE PLANT RAW MATERIALS OF THE MEDICINAL PLANT GROWING IN ARKHANGELSK OBLAST

Research article

Kubasova E.D.^1, *, Korelskaya G.V.², Sukhanov A.E.³, Krylov I.A.⁴, Kubasov R.V.⁵

¹ ORCID: 0000-0001-9683-7814;

² ORCID: 0000-0003-4236-1966;

³ ORCID: 0000-0002-6214-307Х;

⁴ ORCID: 0000-0003-3042-4229;

⁵ ORCID: 0000-0003-1698-6479;

^1-5 Northern State Medical University, Arkhangelsk, Russia

* Corresponding author (lapkino[at]mail.ru)

Abstract

Relevance: biologically active substances identified in the medicinal plant Levisticum officinale W.D.J. Koch are diverse. Among them, coumarins and their derivatives are of considerable interest for pharmacy, since they have a versatile medicinal effect. The purpose of the study is the detection and quantitative determination of coumarins in the medicinal Lovage growing in Arkhangelsk Oblast, for the possible identification of the raw materials of this plant as medicinal. Materials and methods: the presence and quantitative content of coumarins in the raw materials of medicinal lovage growing on the territory of Arkhangelsk Oblast was determined using the spectrophotometric method of chemical analysis. Results of the study: qualitative samples (lactone, reaction with diazoreactive in an alkaline medium) confirmed the presence of coumarins in the roots of the plant; the content of coumarins relative to the total dry mass of raw materials was quantified, it amounted to 0.213 ± 0.009% (95% confidence interval = 0.188-0.238). The results obtained are consistent with the data of other researchers, the average relative proportion of coumarins relative to the total mass of the dry plant corresponds to the average scientific results (included in the range of 0.19 to 0.52%).

Keywords: Medicinal lovage, coumarins.

Введение

Любисток лекарственный (Levisticum officinale W.D.J. Koch) представляет собой многолетнее холодостойкое травянистое растение, широко используемое в различных отраслях хозяйства. Благодаря наличию в нем биологически активных веществ, во многих странах он используется в фармацевтической промышленности и, таким образом, это растение отнесено к лекарственным. Некоторые его составляющие (корни, плоды) включены в Европейскую и Британскую травяную фармакопеи [1]. В Российской Федерации и ряде стран СНГ (Украина, Беларусь, Молдова, Казахстан) это растение также разрешено к медицинскому применению, как однокомпонентное (простое) гомеопатическое лекарственное средство. Среди многочисленного количества разновидностей биологически активных веществ, обнаруженных в Levisticum officinale W.D.J. Koch, особое положение занимают кумарины. Кумарины – класс природных органических соединений, представляющих собой ненасыщенные ароматические лактоны, в основе которых лежит 5,6-бензо-α-пирон (кумарин) — лактон цис-орто-оксикоричной кислоты. Они достаточно часто встречаются в высших растениях, однако наибольшее число их обнаружено в семействе зонтичных, к которым принадлежит Любисток лекарственный. Преимущественная локализация кумаринов в растении – в корнях [2]. Лекарственный эффект кумаринов очень разносторонний, благодаря высокой фармакологической активности. Наиболее изученные лечебные свойства их проявляются в виде спазмолитического, фотосенсибилизирующего, противоопухолевого, антикоагулянтного действия на организм [3]. Физиологическое действие непосредственно самого кумарина на человека является очень слабым. В основном заметный эффект имеют некоторые производные кумарина. Например, производные кумарин-3-карбоновых кислот является снотворными средствами. Дикумарол (3,3'-метилен-бис-4-оксикумарин) препятствует свертыванию крови, его избыток может стать причиной тяжелых кровотечений. Кумарин и его производные являются антагонистами витамина К, которые блокируют в печени синтез витамин-К-зависимых факторов свертывания крови. За счёт этого в медицине кумарин используется в качестве антикоагулянтов непрямого действия. В то же время избыточное попадание и накопление кумаринов в организме приводит к резкому снижению витамина K и, как следствие, склонности к кровотечениям [4]. Наличие и количественное содержание биологически активных субстанций Levisticum officinale W.D.J. Koch может варьировать в зависимости от многочисленных факторов, среди которых одним из ведущих является территория его произрастания [5], [6].

В связи с изложенным, целью нашего исследования явилось обнаружение и количественное определение кумаринов в Любистоке лекарственном, произрастающем в Архангельской области, для возможного определения сырья этого растения в качестве лекарственного.

Материалы и методы

В качестве объекта исследования нами было использовано воздушно-сухое сырье Любистока лекарственного. Ареал произрастания исследуемых образцов – Архангельская область (Верхне-Тоемский район). Время произрастания и сбора – осень 2020 года. Конкретной ботанической частью, с которой проводился анализ, явились корни растения. Следуя соответствующим инструкциям по правилам сбора и сушки лекарственных растений изначально проведена заготовка необходимого растительного сырья [7]. Хранение сырья проводили согласно требованиям правил общей фармакопейной статьей ОФС.1.1.0011.15 [8].

Непосредственное извлечение кумаринов из растительного сырья выполняли с помощью экстрактора Сокслета. Фильтрование исследуемых растворов и экстрактов осуществляли через бумажные фильтры «белая лента» и «синяя лента» (ТУ 2642-001-13927158-2003, Россия).

Спектрофотометрические исследования проводили на спектрофотометре Hitachi U 5100 UV/VIS (Япония) c использованием кювет из кварца 10×10 мм, объемом 3,5 мл с оптимальным пропускающим диапазоном 190-2500 нм.

Реактивы и растворители, используемые в исследовании, отвечали нормативной документации [8].

Наличие биологически активных веществ определяли соответствующими химическими реакциями [9].

Для обнаружения (индикации) кумаринов использовали извлечение, приготовленное следующим образом: 2 г измельченного сырья заливали 20 мл этилового спирта и кипятили в течение 15 минут с обратным холодильником. После охлаждения фильтрат подвергали соответствующим качественным реакциям: лактонная проба; реакция с диазореактивом в щелочной среде [9].

Количественное определение кумаринов в растительном сырье осуществлено согласно «Методике в пересчете на псорален» [9].

Содержание суммы кумаринов X (%), в пересчете на псорален вычисляли по формуле:

где D - оптическая плотность испытуемого раствора при 290 нм;

650 - удельный показатель поглощения псоралена при 290 нм;

а - масса навески сырья, взятого для анализа, г.

Статистическую обработку результатов исследования проводили в соответствии с общей фармакопейной статьей ОФС 1.1.0013.15 «Статистическая обработка результатов химического эксперимента» [8]. Для метрологических характеристик использованы: среднее значение выборки (), стандартное отклонение (SD), среднеквадратическое отклонение (SD²), 95% доверительный интервал (95% ДИ).

Результаты исследования и их обсуждение

Использованные нами качественные химические реакции на предмет обнаружения кумаринов в исследуемых экземплярах растений Levisticum officinale W.D.J. Koch оказались положительными. Так, в процессе проведения лактонной пробы после добавления 10% спиртового раствора калия гидроксида уже с первых минут нагревания на водяной бане окраска раствора стала приобретать желтый цвет. К концу эксперимента (в течение 5 минут) цвет раствора оказался интенсивно желтым. Далее, после охлаждения пробы с добавлением 2 мл очищенной воды, согласно методике, была изменена pH раствора (в сторону ее снижения, до кислой), путем добавления 10% раствора хлористоводородной кислоты. При этом, практически сразу произошло помутнение желтого раствора с дальнейшим выпадением темного осадка. Такие изменения указывают на наличие в обрабатываемых пробах кумаринов.

При проведении реакции диазореактивом в щелочной среде наблюдалась следующая динамика: прозрачный раствор после добавления 10% спиртового раствора калия гидроксида с последующим нагреванием на водяной бане в течение 5 минут изменился на малиново-красный цвет; после добавления диазотированной кислоты сульфаниловой окраски раствора стала насыщенного коричнево-красного цвета. Это свидетельствует о положительной реакции и, соответственно, о присутствии кумаринов в изучаемом растительном сырье

Для определение количественного содержания кумаринов в корнях любистока лекарственного использована методика их вычисления по оптической плотности пробы с последующим пересчетом на псорален.

Изначально, количественное содержание кумаринов определяли в шести повторениях, что является достаточным при проведении аналитических химических исследований при условии нормального распределения полученной выборки. Результаты исследования этих 6 образцов проб, полученных из корней любистока лекарственного представлены в таблице 1.

Суммарное содержание кумаринов рассчитывалось после получения оптической плотности подготовленных проб. Для этого использовали специальную «формулу в пересчете на псорален».

По полученным данным, после полного проведения анализа и всех необходимых расчетов (в т.ч. с использованием формулы пересчета на псорален) относительное содержание суммы кумаринов в сухом сырье составило 0,213±0,009%. Ошибка среднего результата определения кумаринов не превысила 5% уровень.

 

Таблица 1 – Результаты определения содержания кумаринов в корнях любистока лекарственного

№ пробы	Навеска (а), г	Оптическая плотность	Содержание кумаринов, %
1	3,0282	0,294	0,201
2	3,0052	0,151	0,208
3	3,0187	0,326	0,224
4	3,0063	0,305	0,210
5	3,0158	0,306	0,210
6	3,0616	0,335	0,226
Метрологические характеристики	=0,213; SD = 0,0097658; SD2 = 0,00009537 95% ДИ =0,188-0,238

 

Полученные нами результаты исследования по наличию и количественному содержанию кумаринов в корнях Levisticum officinale W.D.J. Koch сопоставимы с данными других исследователей. Так, хроматографический анализ экстракта корня любистока лекарственного на тонком слое сорбента представил информацию о присутствии кумаринов: бергаптена, ангелицина, умбеллиферона и 3-бутиленфталида [6]. Использование метода спектроскопии ядерного магнитного резонанса позволило также выделить кумарины (бергаптен) экстракте корней любистока лекарственного. [10]. Согласно обобщенной имеющейся информации в литературе, количественное содержание кумаринов (в пересчете на псорален) в корнях Levisticum officinale колеблется от 0,19 до 0,52% [11].

Таким образом, наше исследование на предмет наличия и количественного содержания кумаринов в корнях Levisticum officinale W.D.J. Koch, произрастающего в Архангельской области, позволяют отнести это растение к потенциально рекомендуемым к использованию в фармацевтической отрасли.

Конфликт интересов Не указан.

Conflict of Interest None declared.

 

Список литературы / References

1. Novák I. Effect of harvesting time and plant age on some quality parameters of lovage (Levisticum officinale Koch.) / Novák // Acta Hortic. – 2002. – Vol. 576. – P. 311-314.
2. Пастушенков Л.В. Лекарственные растения. Использование в народной медицине и в быту / Л.В. Пастушенков, А.Л. Пастушенков, В.Л. Пастушенков. СПб.: БХВ -Петербург, 2012. 432 с.
3. Пименов М.Г. Перечень растений – источников кумариновых соединений / М.Г. Пименов. – Л.: Наука. Ленингр. отд., 1971. – 200 с.
4. Donaldson M.S. Vitamin K: the missing link to prostate health / M.S. Donaldson // Medical Hypotheses. – 2015. – Vol. 84 (3). – P. 219–222.
5. Валентинов Б.Г. Сырье традиционной китайской медицины. Rhizoma chuanxiong корневище любистока Сычуаньского / Б.Г. Валентинов, Э.М. Наумова, М.М. Олейникова // Вестник новых медицинских технологий. – 2005. – №3-4. – С. 97-100.
6. Assessment report on Levisticum officinale Koch, radix. – 2012 EMA/HMPC/524623/2011 Committee on Herbal Medicinal Products (HMPC)
7. Правила сбора и сушки лекарственных растений: сборник инструкций / отв. ред. А. И. Шретер и др. - М.: Медицина, 1985. – 328 с.
8. Государственная Фармакопея РФ. Том 1 / Министерство здравоохранения РФ –14-е изд. – Москва, 2018. – 1814 с.
9. Гринкевич Н.И. Химический анализ лекарственных растений: Учебное пособие для фармацевтических вузов / Н.И. Гринкевич, Л.Н. Сафронич, М.Я. Ладыгина и др.: М: Высшая школа, 1983.-176 с.
10. Monsefesfahani H. Antibacterial Components of Levisticum officinale Koch against Multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis / M.M. Farimani et al. // Pharmaceutical Sciences. – 2020. – Vol. 26(4). – P. 441-47.
11. Яницкая А.В. Анатомо-морфологическое изучение плодов Psoralea corylifolia L. (Fabaceae) / А.В. Яницкая, М.А. Ярковой, Е.В. Малаева и др. // Волгоградский научно-медицинский журнал. – 2019. – №3. – C. 58-61.

Список литературы на английском языке / References in English

1. Novák I. Effect of harvesting time and plant age on some quality parameters of lovage (Levisticum officinale Koch.) / Novák // Acta Hortic. – 2002. – Vol. 576. – P. 311-314.
2. Pastushenkov L.V. Lekarstvennye rastenija. Ispol'zovanie v narodnoj medicine i v bytu [Pharmaceutical plants. Use in traditional medicine] / L.V. Pastushenkov, A.L. Pastushenkov, V.L. Pastushenkov. St-Pb.: BHV-Petersburg, 2012. – 432 p. [in Russian]
3. Pimenov M.G. Perechen' rastenij – istochnikov kumarinovyh soedinenij [List of plants – sources of coumarin compounds] / M.G. Pimenov. – L.: Nauka. Leningrad Dpt., 1971. – 200 p. [in Russian]
4. Donaldson M.S. Vitamin K: the missing link to prostate health / M.S. Donaldson // Medical Hypotheses. – 2015. – Vol. 84 (3). – P. 219–222.
5. Valentinov B.G. Syr'e tradicionnoj kitajskoj mediciny. Rhizoma chuanxiong kornevishhe ljubistoka Sychuan'skogo [Starting materials of traditional China medicine: Rhizoma Chianxiong] / B.G. Valentinov, E.M. Naumova, M.M. Oleynikova // Vestnik novyh medicinskih tehnologij [Journal of new medical technologies]. – 2005. – №3-4. – P. 97-100. [in Russian]
6. Assessment report on Levisticum officinale Koch, radix. – 2012 EMA/HMPC/524623/2011 Committee on Herbal Medicinal Products (HMPC)
7. Pravila sbora i sushki lekarstvennyh rastenij: sbornik instrukcij [Rules for the selection and drying of medicinal plants: a collection of instructions] / ed. By А.I. Shreter et al. - Moscow: Medicine, 1985. – 328 p. [in Russian]
8. Gosudarstvennaja Farmakopeja RF [State Pharmacopoeia of the Russian Federation]. Vol. 1 / Ministry of Russian Federation –14-th. edition – Moscow, 2018. – 1814 p. [in Russian]
9. Grinkevich N.I. Himicheskij analiz lekarstvennyh rastenij: Uchebnoe posobie dlja farmacevticheskih vuzov [Chemical analysis of medicinal plants: Textbook for pharmacy Universities] / N.I. Grinkevich, L.N. Safronich, M,Ya, Ladygina et al.: M: Vyscshya shkola, 1983. – 176 p. [in Russian]
10. Monsefesfahani H. Antibacterial Components of Levisticum officinale Koch against Multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis / M.M. Farimani et al. // Pharmaceutical Sciences. – 2020. – Vol. 26(4). – P. 441-47.
11. Yanitskaya A.V. Anatomo-morfologicheskoe izuchenie plodov Psoralea corylifolia L. (Fabaceae) [Anatomic-morphological investigation of fruits Psoralea corylifolia L. (Fabaceae)] / A.V. Yanitskaya, М.А. Yarkovoy, Е.V. Malaevaet al. // Volgogradskij nauchno-medicinskij zhurnal [Volgograd Journal of Medical Research]. – 2019. – №3. – P. 58-61. [in Russian]