НЕКОТОРЫЕ АСПЕКТЫ ФИТОХИМИЧЕСКОГО АНАЛИЗА ЭКСТРАКТА ХЛОРЕЛЛЫ

НЕКОТОРЫЕ АСПЕКТЫ ФИТОХИМИЧЕСКОГО АНАЛИЗА ЭКСТРАКТА ХЛОРЕЛЛЫ

Научная статья

Митишев А.В.^1, *, Моисеев Я.П.², Курдюков Е.Е.³, Пронькина А.А.⁴, Семенова Е.Ф.⁵

¹ ORCID: 0000-0002-3327-9744;

³ ORCID: 0000-0001-9512-6770;

^1-4 Пензенский государственный университет, Пенза, Россия;

⁵ Медицинская академия имени С.И. Георгиевского «КФУ им. В.И. Вернадского», Симферополь, Россия

* Корреспондирующий автор (span2361[at]rambler.ru)

Аннотация

В последние годы в фармацевтической технологии особое внимание уделяется фитопрепаратам. Данная группа лекарственных средств включает в себя растительные экстракты, содержащие комплекс биологически активных соединений, который обладает широким спектром действия, хорошей переносимостью и низким риском развития нежелательных реакций.

Целью проведенного исследования являлось изучение влияния экстрагентов на компонентный состав экстракта хлореллы и разработка качественных методов анализа.

Исследования показали, что экстракты, полученные с помощью различных экстрагентов из биомассы Chlorella vulgaris штаммов С-2019, С-11, С-16, С-98 содержат широкий спектр биологически активных соединений, таких как флавоноиды, терпеноиды, алкалоиды, гликозиды и сапонины. Помимо прочего были проведены качественные реакции на основные биологически активные соединения, которые в дальнейшем могут использоваться для подтверждения качества экстрактов хлореллы.

Ключевые слова: микроводоросли, Chlorella vulgaris, качественные реакции, флавоноиды, дубильные вещества.

SOME ASPECTS OF PHYTOCHEMICAL ANALYSIS OF CHLORELLA EXTRACT

Research article

Mitishev A.V.^1, *, Moiseev Ya.P.², Kurdyukov Е.Е.³, Pronkina A.A.⁴, Semenova E.F.⁵

¹ ORCID: 0000-0002-3327-9744;

³ ORCID: 0000-0001-9512-6770;

^1-4 Penza State University, Penza, Russia;

⁵ Medical Academy named after S.I. Georgievsky of Vernadsky CFU, 4 Simferopol, Russia

*Corresponding author (span2361[at]rambler.ru)

Abstract

Recently, much attention has been paid to phytopreparations in pharmaceutical technology. This group of medicines includes plant extracts containing a complex of biologically active compounds with a wide spectrum of action, good tolerability and a low risk of adverse reactions. In this regard, the purpose of this study was to study the effect of the extractant on the component composition of chlorella extract and to develop qualitative methods of analysis. The conducted studies have shown that extracts obtained with the help of various extractants from biomass C vulgaris strains C-2019, C-11, C-16, C-98 contain a wide range of biologically active compounds, such as flavonoids, terpenoids, alkaloids, glycosides and saponins. Qualitative reactions were carried out on the main biologically active compounds, which can later be used to confirm the quality of chlorella extracts.

Keywords: microalgae, Chlorella vulgaris, qualitative reactions, flavonoids, tannins.

Введение

В океане микроводоросли являются основными продуцентами более шестидесяти видов органических веществ, включая минералы, белки и многие другие биологически активные соединения [1]. Главным видимым преимуществом микроводорослей перед другими организмами является то, что они являются фотоавтотрофами и поэтому не требуют органических веществ для выращивания, следовательно, их крупномасштабное культивирование теоретически проще и дешевле [2]. Микроводоросли используются в различных отраслях промышленности, таких как пищевая, косметическая, нутрицевтическая, медицинская, фармацевтическая и сельскохозяйственная. Они синтезируют вторичные метаболиты для защиты от других микроорганизмов. В связи с этим, данные соединения могут быть использованы для борьбы с инфекционными заболеваниями.

Большая часть фитохимических соединений накапливается в биомассе микроводорослей. Многие из биологически и фармакологически активных соединений, выделенных из микроводорослей, трудно синтезировать химическим путем [2]. Было обнаружено, что большинство экстрактов микроводорослей и цианобактерий обладают антибактериальной, противогрибковой, противоопухолевой, противовирусной, антиоксидантной активностью [3].

Антимикробное действие экстрактов водорослей можно объяснить их фенольными компонентами [6]. Окислительное повреждение липидов, белков и нуклеиновых кислот, вызванное активными формами кислорода, может вызвать различные хронические заболевания, такие как ишемическая болезнь сердца, атеросклероз, рак и преждевременное старение организма [4]. Применение выделенных из микроводорослей антиоксидантных соединений, таких как каротиноиды, терпеноиды, полисахариды, пептиды, белки, витамины, акриловая кислота, терпены, хлорофиллиды, фенолы, гетероциклические соединения, стероиды, аминокислоты, флоротаннины, фенольные соединения, галогенированные кетоны, алканы и циклические полисульфиды, защищает от заболеваний, связанных с неправильным образом жизни [5].

В настоящее время фармацевтическая промышленность придает все большее значение соединениям, полученным традиционным путем из растений, и нетрадиционным – с помощью морских организмов [7], [8]. Настоящее исследование было сосредоточено на разработке качественных методов определения фитохимических соединений микроводорослей.

Методы и принципы исследования

Объектом исследования являлась воздушно-сухая биомасса штаммов Chlorella vulgaris Beyerinck ИФР C-2019, С-11, С-16 и С-98, выращенная глубинным методом на среде Тамия при 16 часовом фотопериоде и температуре 28-30 °С. Высушенную биомассу хлореллы подвергали предварительной обработке органическими растворителями при температуре 60°С в течение 20 мин с использованием обратного холодильника с последующим выпариванием растворителя. В качестве растворителя использовали смесь этанол – ацетон - серный эфир (1:4:10). Для получения экстрактов использовали 5 экстрагентов: спирт этиловый 95%, ацетон (ХЧ), петролейный эфир (ХЧ), гексан (ХЧ) и гептан (ХЧ). Полученные экстракты для дальнейшего использования хранили при температуре от 2 до 4°С. Затем их исследовали на наличие дубильных веществ, флавоноидов, терпеноидов, стероидов, сапонинов, гликозидов и алкалоидов.

Методики определения:

1. Качественные реакции на дубильные вещества:

1.1. 1 мл экстракта хлореллы смешивали с 50 мл дистиллированной воды и по капле добавляли 1% раствор хлорида железа. Образование темно-зеленого раствора указывало на наличие дубильных веществ.

1.2 1 мл экстракта хлореллы смешивали с 50 мл дистиллированной воды и по капле добавляли железоаммонийные квасцы. Образование темно-зеленого раствора указывало на наличие дубильных веществ.

2. Качественные реакции на флавоноиды:

2.1. К 1 мл экстракта водорослей добавляли магний и несколько капель концентрированной HCl. На присутствии флавоноидов указывало красное или оранжевое окрашивание, обусловленное образованием антоцианидинов.

2.2. 0,5 мл экстракта водорослей растворяли в 1 мл 10% NaOH и добавляли несколько капель концентрированной HCl. На присутствии флавоноидов указывало исчезновение желтого окрашивания раствора.

3. Качественная реакция на терпеноиды:

К 1 мл экстракта добавляли 0,400 мл хлороформа и смешивали. Затем добавляли несколько капель концентрированной серной кислоты. Образовалась красновато-коричневая граница раздела, что указывало на присутствие терпеноидов.

4. Качественная реакция на гликозиды (Реакция Балье):

Для анализа необходима свежеприготовленная смесь гидроксида натрия и пикриновой кислоты (среда раствора щелочная).

1 мл извлечения выпаривали на водяной бане. Сухой остаток растворяли в 1 мл этанола. Полученный спиртовой раствор перелили в пробирку и добавили 1 мл свежеприготовленного раствора пикрата натрия. Постепенное появление оранжевого, розового или красного окрашивания указывало на присутствие гликозидов.

5. Качественная реакция на алкалоиды:

К экстракту микроводорослей добавляли несколько капель реагента Вагнера (раствор йода в йодиде калия). Появление красновато-коричневого осадка указывало на наличие алколоидов.

6. Качественная реакция на сапонины:

К 1 мл экстракта микроводорослей добавляли несколько капель 1 % хлорида железа. Вспенивание или появление кремообразной массы из мелких пузырьков указывало на присутствие сапонинов.

Основные результаты

Биомассу четырех штаммов Chlorella vulgaris экстрагировали пятью различными растворителями. Фитохимические вещества, присутствующие в экстрактах микроводорослей, были идентифицированы как флавоноиды, терпеноиды, алкалоиды, гликозиды и сапонины (см. таблицу 1). Все экстракты микроводорослей в своем составе содержали флавоноиды. Известно, что реакции на флавоноиды основаны на образовании окрашенных комплексных соединений. В качестве основной специфической реакции на флавоноиды использовалась цианидиновая проба (проба Шинода).

Таблица 1 – Фитохимический анализ различных экстрактов Chlorella vulgaris

Штамм C. vulgaris	Экстракт	Дубильные вещества	Флавоноиды	Терпеноиды	Гликозиды	Алколоиды	Сапонины
С- 2019	Ацетоновый	++	++	-	++	-	-
	Спиртовой	+++	+++	+	+	-	+
	Гептановый	++	++	-	-	+	-
	Гексановый	++	+	-	+	+	-
	Петролейный	++	+++	+	-	+	+
С - 11	Ацетоновый	++	++	-	+	+	-
	Спиртовой	+++	+	-	+	-	-
	Гептановый	++	+	++	+	-	-
	Гексановый	++	++	-	+	-	-
	Петролейный	+	++	++	-	-	-
Штамм C. vulgaris	Экстракт	Дубильные вещества	Флавоноиды	Терпеноиды	Гликозиды	Алколоиды	Сапонины
С - 16	Ацетоновый	++	+	-	+	-	-
	Спиртовой	+++	+	+	-	-	+
	Гептановый	++	++	+	-	+	-
	Гексановый	+	+	-	-	+	-
	Петролейный	++	++	-	+	-	-
С - 98	Ацетоновый	+	+	-	+	-	-
	Спиртовой	+++	+	-	-	-	+
	Гептановый	+	++	-	-	-	-
	Гексановый	+	+	-	+	+	-
	Петролейный	++	++	+	-	+	-

Примечание: Высокая концентрация (+++), Умеренная концентрация (++), Низкая концентрация (+) и отсутствие (-)  

Флавоноиды являлись преобладающими фитохимическими веществами и обнаруживались во всех экстрактах, полученных с помощью различных экстрагентов. Наиболее высокие показатели содержания наблюдались в спиртовых и петролейных экстрактах штамма С-2019. Также во всех экстрактах микроводорослей присутствовали дубильные вещества.

В основном алкалоиды присутствовали в гептановых, а сапонины в спиртовых экстрактах. Терпеноиды и гликозиды встречались в экстрактах биомассы штамма С-11.

Заключение

Проведенные исследования экстрактов, полученных с помощью различных экстрагентов из биомассы C. vulgaris штаммов С-2019, С-11, С-16, С-98 показали, что в исследуемых растворах содержится широкий спектр биологически активных соединений: флавоноиды, терпеноиды, алкалоиды, гликозиды и сапонины. Проведенные испытания на данные соединения могут быть использованы для подтверждения качества экстрактов хлореллы.

Конфликт интересов Не указан.

Conflict of Interest None declared.

 

Список литературы / References

1. Asthana R.K. Isolation and identification of a new antibacterial entity from the Antarctic cyanobacterium Nostoc CCC 537 / R.K. Asthana, M.K. Tripathi, A. Srivastava, et al. // J ApplPhycol. – 2009. - № 21(1). – Р. 81-88.
2. Ramaraj S. Abd Allah. Microalgae metabolites: A rich source for food and medicine / S. Ramaraj, R. Ramalingam, H. Abeer, et al. // Saudi Journal of Biological Sciences. – 2019. - № 26. Р. 709–722.
3. Barkia I. Microalgae for High-Value Products towards Human Health and Nutrition / I. Barkia, N. Saari, S.R. Manning // Mar Drugs. – 2019. - № 17(5). – Р. 304.
4. Finkel T. Oxidants, oxidative stress and the biology of ageing / T. Finkel, N.J. Holbrook // Nature. – 2008. - № 408. – Р. 239–247.
5. Seghiri R. Functional Composition, Nutritional Properties, and Biological Activities of Moroccan Spirulina Microalga / R. Seghiri, M. Kharbach, A. Essamri // Journal of Food Quality. – 2019. – Р. 1-11.
6. Митишев А. В. Микроводоросли как новый источник биологически активных соединений, обладающих антибактериальной активностью / А. В. Митишев, Е. Е. Курдюков, О. П. Родина и др. // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. – 2021. – Т. 24. – № 7. – С. 24-29.
7. Salem W.M. Screening for antibacterial activities in some marine algae from the red sea / W.M. Salem // Afr J Microbiol Res. – 2011. - № 5. – Р. 2160-2167.
8. Gorniak I. Comprehensive review of antimicrobial activities of plant flavonoids / I. Gorniak, R. Bartoszewski, J. Kroliczewski // Phytochem Rev. – 2019. – № 18. – Р. 245-256.
9. Куркина А.В. Актуальные вопросы химической стандартизации лекарственных растений, содержащих флавоноиды / А.В. Куркина // Фармация. – 2012. – Т. 60, №7. – С. 44–48.
10. Куркин В.А. Количественное определение суммы флавоноидов в побегах черники обыкновенной / В.А. Куркин, Т.К. Рязанова // Химико-фармацевтический журнал. – 2013. – Т. 47, №4. – С. 34–37.
11. Государственная Фармакопея Российской Федерации. XIV издание. М., 2018. – Т. 2. – 3262 c.

Список литературы на английском языке / References in English

1. Asthana R.K. Isolation and identification of a new antibacterial entity from the Antarctic cyanobacterium Nostoc CCC 537 / R.K. Asthana, M.K. Tripathi, A. Srivastava, et al. // J ApplPhycol. – 2009. - № 21(1). – Р. 81-88.
2. Ramaraj S. Abd Allah. Microalgae metabolites: A rich source for food and medicine / S. Ramaraj, R. Ramalingam, H. Abeer, et al. // Saudi Journal of Biological Sciences. – 2019. - № 26. Р. 709–722.
3. Barkia I. Microalgae for High-Value Products towards Human Health and Nutrition / I. Barkia, N. Saari, S.R. Manning // Mar Drugs. – 2019. - № 17(5). – Р. 304.
4. Finkel T. Oxidants, oxidative stress and the biology of ageing / T. Finkel, N.J. Holbrook // Nature. – 2008. - № 408. – Р. 239–247.
5. Seghiri R. Functional Composition, Nutritional Properties, and Biological Activities of Moroccan Spirulina Microalga / R. Seghiri, M. Kharbach, A. Essamri // Journal of Food Quality. – 2019. – Р. 1-11.
6. Mitishev A. V. Mikrovodorosli kak novyj istochnik biologicheski aktivnyh soedinenij, obladajushhih antibakterial'noj aktivnost'ju [Microalgae as a new source of biologically active compounds with antibacterial activity] / A. V. Mitishev, E. E. Kurdjukov, O. P. Rodina et al. // Problems of biological, medical and pharmaceutical chemistry. – 2021. – Vol. 24. – № 7. – P. 24-29. [in Russian]
7. Salem W.M. Screening for antibacterial activities in some marine algae from the red sea / W.M. Salem // Afr J Microbiol Res. – 2011. - № 5. – Р. 2160-2167.
8. Gorniak I. Comprehensive review of antimicrobial activities of plant flavonoids / I. Gorniak, R. Bartoszewski, J. Kroliczewski // Phytochem Rev. – 2019. – № 18. – Р. 245-256.
9. Kurkina A.V. Aktual'nye voprosy himicheskoj standartizacii lekarstvennyh rastenij, soderzhashhih flavonoidy [Topical issues of chemical standardization of medicinal plants containing flavonoids] / A.V. Kurkina // Pharmacy. – 2012. – Vol. 60, №7. – P. 44–48. [in Russian]
10. Kurkin V.A. Kolichestvennoe opredelenie summy flavonoidov v pobegah cherniki obyknovennoj [Quantitative determination of the amount of flavonoids in blueberry shoots] / V.A. Kurkin, T.K. Rjazanova // Pharmaceutical Chemistry Journal. – 2013. – Vol. 47, №4. – P. 34–37. [in Russian]
11. Gosudarstvennaja farmakopeja Rossijskoj Federacii [State Pharmacopoeia of the Russian Federation]. Edition. XIV. Vol 3. Ministerstvo zdravoohranenija Rossijskoj Federacii. M. 2018; 3262 p. [in Russian]