ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ОБЩЕГО АНТИОКСИДАНТНОГО ИНДЕКСА ДЛЯ ИНТЕГРАЛЬНОЙ ОЦЕНКИ АНТИОКСИДАНТНОГО СТАТУСА ТКАНЕЙ ГОЛОВНОГО МОЗГА КРЫС НА ФОНЕ МЕХАНИЧЕСКОЙ ТРАВМЫ ГЛАЗА

ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ОБЩЕГО АНТИОКСИДАНТНОГО ИНДЕКСА ДЛЯ ИНТЕГРАЛЬНОЙ ОЦЕНКИ АНТИОКСИДАНТНОГО СТАТУСА ТКАНЕЙ ГОЛОВНОГО МОЗГА КРЫС НА ФОНЕ МЕХАНИЧЕСКОЙ ТРАВМЫ ГЛАЗА

Научная статья

Девяткин А.А.¹, Борискин П.В.², Гуленко О.Н.^3, *, Каримова Р.Г.⁴, Леонов В.В.⁵, Павлова О.Н.⁶, Тороповский А.Н.⁷

¹ ORCID: 0000-0001-7506-8040;

³ ORCID: 0000-0001-6338-709;

⁶ ORCID: 0000-0002-8055-1958;

⁷ ORCID: 0000-0001-9779-5708;

^{1, 2, 7} ООО «ТестГен», Ульяновск, Россия;

^{3, 6} Самарский государственный университет путей сообщения», Самара, Россия;

⁴ Казанская государственной академия ветеринарной медицины имени Н.Э. Баумана, Казань, Россия;

⁵ Медицинский университет «Реавиз», Самара, Россия

* Корреспондирующий автор (gulenko_ol[at]mail.ru)

Аннотация

Гематоофтальмический барьер защищает ткани нервной системы от неблагоприятных факторов, но может препятствовать действию естественных антиоксидантов, тем самым способствуя накоплению нейротоксинов и провоцируя развитие цикличных патологических процессов. Однако на фоне воспалительного процесса крупные молекулы, в том числе медикаменты, способны проникать в глазное яблоко. Так же проницаемость гематоофтальмического барьера повышается при разнообразных повреждениях (механических, физических, химических, биологических, биолого-химических). На данный момент механизм восстановления гомеостатического равновесия организма при оксидативном стрессе изучен недостаточно. Тем более актуальным является исследование механизма патогенеза и терапии воспалительных процессов органов зрения. Цель исследования в изучении динамики общего антиоксидантного индекса для интегральной оценки антиоксидантного статуса тканей головного мозга крыс при оксидативном стрессе, вызванном механическим воздействием на гематоофтальмический барьер. Материалы и методы: Исследование проводили на беспородных белых половозрелых здоровых крысах-самцах шестимесячного возраста, массой 220-240 г в количестве 150 штук. Все животные были поделены на 5 групп по тридцать крыс в каждой группе. 1 группа крыс – интактные животные. 2, 3, 4 и 5 группы – экспериментальные, где всем животным наносили проникающее ранение обоих глаз. Животным 2 группы не проводили терапию механической травмы глаза. Крысы 3 группы получали стандартную терапию травмы глаза, животные 4 группы – стандартную терапию с добавлением инъекций кверцетина внутрибрюшинно и 5 группы – только инъекции кверцетина. В тканях головного мозга крыс определяли активность каталазы, СОД, ГП и ГР, а также концентрации МДА и ДК до начала опыта и на 1, 3, 5, 7 и 14 сутки эксперимента, а затем рассчитывали общий антиоксидантный индекс для каждых суток и каждой группы животных. Полученный цифровой материал подвергали статистической обработке путем непараметрического статистического анализа. Выводы: антиоксидантный статус тканей головного мозга крыс при оксидативном стрессе, вызванном механическим воздействием на гематоофтальмический барьер, наиболее эффективно стабилизируется при стандартной терапии механической травмы глаза с добавлением кверцетина в виде инъекций.

Ключевые слова: оксидативный стресс, головной мозг, гематоофтальмический барьер, крысы, каталаза, супероксиддисмутаза, глутатионпероксидаза, глутатионредуктаза, малоновый диальдегид, диеновые конъюгаты, общий антиоксидантны индекс.

APPLICATION OF GENERAL ANTIOXIDANT INDEX FOR INTEGRAL ASSESSMENT OF ANTIOXIDANT STATUS OF RAT BRAIN TISSUES ASSOCIATED WITH MECHANICAL EYE INJURY

Research article

Devyatkin A.A.¹, Boriskin P.V.², Gulenko O.N. ^3, *, Karimova R.G.⁴, Leonov V.V.⁵, Pavlova O.N.⁶, Toropovsky A.N.⁷

¹ ORCID: 0000-0001-7506-8040;

³ ORCID: 0000-0001-6338-709;

⁶ ORCID: 0000-0002-8055-1958;

⁷ ORCID: 0000-0001-9779-5708;

^{1, 2, 7} TestGen LLC, Ulyanovsk, Russia;

^{3, 6} Samara State Transport University, Samara, Russia;

⁴ Bauman Kazan State Academy of Veterinary Medicine", Kazan, Russia;

⁵ Reaviz Medical University, Samara, Russia

* Corresponding author (gulenko_ol[at]mail.ru)

Abstract

The blood-ocular barrier protects the tissues of the nervous system from adverse factors, but it can interfere with the action of natural antioxidants, thereby contributing to the accumulation of neurotoxins and provoking the development of cyclic pathological processes. However, large molecules, including medicines associated with the inflammatory process, can penetrate the eyeball. Besides, the permeability of the blood-ocular barrier increases with various injuries (mechanical, physical, chemical, biological, and biochemical). Currently, the homeostatic balance restoring mechanism of the body under oxidative stress has not been studied enough. Therefore, the research of the pathogenesis mechanism and therapy of inflammatory processes in the organs of vision is of great importance. The goal of this work is to study the dynamics of the total antioxidant index for the integral assessment of the antioxidant status of rat brain tissues under oxidative stress caused by mechanical action on the blood-ophthalmic barrier. Materials and Methods: The work was carried out on outbred white sexually mature healthy male rats of six months, weighing 220-240 g, 150 animals were tested. They were divided into five groups with thirty rats in each group— the 1^st group of rats – intact animals. The 2^nd, 3^rd, 4^th, and 5^th were experimental ones, where all animals got penetrating wounds in both eyes. Animals in the 2^nd group did not get any mechanical eye injury therapy. The rats of the 3^rd group got standard therapy for eye injury. The animals of the 4^th group got standard therapy with the addition of intraperitoneal quercetin injections, and those of the 5^th group got only quercetin injections. The activity of catalase, cumulative dose, GP and GR, as well as the concentrations of MDA and DC before the start of the experiment and on days No. 1, 3, 5, 7, and 14 of the experiment, were determined in the rat brain tissues. Then the total antioxidant index was calculated for each day and each group of animals. The resulting digital material was subjected to statistical processing by nonparametric statistical analysis. Conclusions: the antioxidant status of rat brain tissues under oxidative stress caused by mechanical action on the blood-ocular barrier can be most effectively stabilized by standard therapy of mechanical eye injury with the addition of quercetin in the form of injections.

Keywords: oxidative stress, brain, blood-ocular barrier, rats, catalase, superoxide dismutase, glutathione peroxidase, glutathione reductase, malondialdehyde, diene conjugates, total antioxidant index.

Введение

В результате механической травмы глаза и повреждения гематоофтальмического барьера возникает воспалительный процесс и, как следствие, оксидативный стресс – это состояние организма, развивающееся на фоне перепроизводства свободных радикалов, при нарушении эффективности антиоксидантной защиты [1], [2]. Подобное состояние приводит к развитию широкого спектра патологий [3], [4]. За счет большого содержания липидов и жирных кислот, способных окисляться с образованием токсичных соединений и интенсивного потребления кислорода самой большой мишенью для свободных радикалов становятся ткани нервной системы [5], [6]. Чем больше функциональная нагрузка на нервную систему, тем больше требуется кислорода, а, следовательно, образуется большее количество свободных радикалов. Но ткани нервной системы, в частности головной мозг, испытывают дефицит ферментов, способствующих деактивации активных форм кислорода. Гематоэнцефалический и гематоофтальмический барьеры защищают ткани нервной системы от негативных воздействий, но в тоже время препятствуют действию естественных антиоксидантов. При длительном оксидативном стрессе возможно накопление клетками микроглии медиаторов воспаления, которые в свою очередь способствуют выработке активных форм кислорода, обеспечивая цикличность патологических процессов [7]. При этом нарушается функционирование защитных барьеров, сопровождающееся проникновением нейротоксинов, способствующих развитию нейродегенеративных заболеваний [8], [9]. Раскрытие молекулярных механизмов подобных патогенетических процессов находится в основе разработки эффективных терапевтических подходов.

Оценку окислительного гомеостаза организма, как правило проводят путем исследования активности каталазы, супероксиддисмутазы (СОД), глутатионпероксидазы (ГП) и глутатионредуктазы (ГР), а также концентрации малонового диальдегида (ДК) и диеновых коньюгатов (ДК), но на практике целесообразно использовать не разрозненные параметры, а интегрированные показатели, что повышает информативность результатов исследований и позволяет достоверно оценить невысокие отклонения в антиоксидантном статусе организма.

Таким образом, цель нашего исследования состояла в изучении динамики общего антиоксидантного индекса для интегральной оценки антиоксидантного статуса тканей головного мозга крыс при оксидативном стрессе, вызванном механическим воздействием на гематоофтальмический барьер.

Для реализации поставленной цели предстояло решить следующие задачи: определить в динамике активность каталазы, СОД, ГП и ГР, а также концентрации МДА и ДК в тканях головного мозга интактных крыс и крыс с механической травмой глаза, провоцирующей оксидативный стресс; рассчитать в динамике общий антиоксидантный индекс и провести интегральную оценку антиоксидантного статуса тканей мозга крыс при применении различных методов терапии травмы глаза.

Материалы и методы

Исследование проводили на беспородных белых половозрелых здоровых крысах-самцах шестимесячного возраста, массой 220-240 г в количестве 150 штук, которые содержались в стандартных условиях вивария. Все животные были поделены на 5 групп по тридцать крыс в каждой группе. 1 группа крыс – интактные животные. 2, 3, 4 и 5 группы – экспериментальные, где всем животным наносили проникающее ранение обоих глаз. Животным 2 группы не проводили терапию механической травмы глаза. Крысы 3 группы получали стандартную терапию травмы глаза, животные 4 группы – стандартную терапию с добавлением инъекций кверцетина внутрибрюшинно и 5 группы – только инъекции кверцетина. Подробная методика проведения эксперимента представлена нами в ранее опубликованной работе [10]. Животные во время эксперимента находились при свободном доступе к воде и пищи на стандартном рационе вивария [11].

Активность каталазы, СОД, ГП и ГР, а также концентрации МДА и ДК в тканях головного мозга исследовали до начала опыта, а также на 1, 3, 5, 7 и 14 сутки эксперимента. Активность каталазы определяли по методу Королюка М.А.. Активность СОД определяли по методу В.С. Гуревича. Определение активности ГП осуществляли по методу В.М. Мойн. Активность ГР определяли по накоплению окисленного глутатиона. Определение концентрации МДА осуществляли по методике Рогожина В.В. Определение концентрации ДК осуществляли спектрометрическим методом [11].

В соответствии с этическими нормами крыс декапитировали под эфирным наркозом, проводили извлечение головного мозга из которого готовили гомогенаты [11].

Для интегральной оценки антиоксидантного статуса тканей мозга крыс проводили расчет общего антиоксидантного индекса (АОИ_общ), как комплексного показателя, включающего все изучаемые параметры [12].

АОИ_общ рассчитывали по формуле:

АОИ = АОИ₁ - АОИ₂ = [(ГПоп/ГПконтр. + ГРоп/ГРконтр. + СОДоп/СОДконтр. + КАТоп/КАТконтр.)/4)] - [(ДКоп./ДКоп. контр. + МДАоп./МДА. контр.)/2],

где, АОИ – антиоксидантный индекс;

АОИ₁ – суммарное значение для основных ферментов АОС-системы;

АОП₂ – суммарное значение для продуктов ПОЛ;

ГПоп., ГРоп., СОДоп., КАТоп., ДКоп. и МДАоп. – активность или концентрация соответствующего фермента у животных, с индуцированным оксидативным стрессом и различным типом терапии травмы глаза;

ГПконтр., ГРконтр., СОДконтр., КАТконтр., ДКконтр. и МДАконтр. – активность или концентрация соответствующего фермента у интактных животных;

На проведение эксперимента получено заключение Комитета по биоэтике при «Медицинском университете «Реавиз» № 163 от 29 августа 2019 г.

Полученный цифровой материал подвергали статистической обработке путем непараметрического статистического анализа.

Основные результаты

Исследование общего антиоксидантного индекса в тканях головного мозга крыс четырех экспериментальных групп представлено на рисунке 1.

 

Рис.1 – Уровень АОИ_общ в тканях головного мозга крыс на фоне оксидативного стресса

По данным рисунка видно, что АОИ_общ в тканях головного мозга крыс во всех экспериментальных группах до начала эксперимента был около нуля, что соответствует сбалансированному состоянию окислительно-восстановительных процессов в организме. Динамика АОИ_общ в тканях головного мозга крыс 2 группы с индуцированным оксидативным стрессом путем механической травмы глаза имеет тенденцию к снижению с течением времени, что свидетельствует об интенсификации процессов перекисного окисления липидов. В 3, 4 и 5 группах животных, получавших развличные виды терапии механической травмы глаза, АОИ_общ в тканях головного мозга также снижался до 7 суток опыта, а затем, на 14 сутки возрастал. Особенно выраженно это у крыс 4 группы, которым проводили стандартную терапию травмы глаза в комплексе с инъекциями кверцетина внутрибрюшинно, так как АОИ_общ к концу эксперимента приблизился к нулю. Компенсация антиоксидантной системы у крыс 3 группы (стандартная терапия травмы глаза) была выражена интенсивнее, чем у животных 5 группы (терапия только инъекциями кверцетина), по-видимому потому, что стандартная терапия травмы глаза снижает воспаление, уменьшая интенсивность окислительных процессов и стимулирует активность антиоксидантных ферментов, а чистого кверцетина недостаточно для восстановления окислительно-восстановительного равновесия.

Обсуждение

Механическая травма глаза является стимулятором окислительных процессов в организме, так как токсичные продукты аутолиза поврежденных тканей поступают в кровь и интенсифицируют окисление и выработку свободных радикалов. Это нарушает окислительно-восстановительное равновесие в организме, что отражается на состоянии ферментов системы перекисного окисления липидов – антиоксидантов. При этом в тканях организма снижается активность каталазы, СОД, ГП и ГР, но возрастает концентрация МДА И ДК. Ткани мозга не являются исключением и соответственно реагируют на механическую травму глаза, а в дополнение сам головной мозг обладает высокой метаболической активностью и низким уровнем эндогенных антиоксидантов.

Применение различных видов терапии моделирует окислительный гомеостаз тканей головного мозга и расчет общего антиоксидатного индекса позволяет выявить незначительные колебания пошатнувшегося окислительно-восстановительного равновесия.

В нашем исследовании на крысах установлено, что при применении помимо стандартной терапии механической травмы глаза инъекций кверцетина динамика общего антиоксидантного индекса в тканях головного мозга после падения на фоне окислительного стресса, спровоцированного механической травмой глаза, возвращается к значениям физиологической нормы к 14 суткам опыта, что свидетельствует об эффективном купировании оксидативного стресса и стабилизации антиоксидантной системы.

Стандартная терапия механической травмы глаза достаточно эффективно подавляет воспалительные процессы, но не стимулирует активность антиоксидантной системы организма, а кверцетин отчасти эффективен в отношении подавления синглетного кислорода и активации антиоксидантных ферментов организма, но не купирует воспаление. Возможно, такой эффект кверцетина обусловлен тем, что использование для подавления окислительного стресса синтетических антиоксидантов может нарушать сигнальную роль свободных радикалов и тем самым ухудшать адаптационные возможности организма [13].

Заключение

Антиоксидантный статус тканей головного мозга крыс при оксидативном стрессе, вызванном механическим воздействием на гематоофтальмический барьер, наиболее эффективно стабилизируется при стандартной терапии механической травмы глаза с добавлением кверцетина в виде инъекций.

Конфликт интересов Не указан.

Conflict of Interest None declared.

Список литературы / References

1. Коцур В.А. Оксидативный стресс и антиоксидантная защита организма / В.А. Коцур, Д.Ф. Валиулина // Материалы XIII Международной научно-практической конференции. – Магнитогорск: Изд-во гос.техн.ун-та им. Г.И. Носова. – 2018. – С. 163-164;
2. Курашвили В.А. Новые возможности предотвращения оксидативного стресса / В.А. Курашвили, Л. Майлэм // Журнал натуральной медицины. – 2001. – № 1. – С. 7-14.
3. Нагорная Н.В. Оксидативный стресс: влияние на организм человека, методы оценки / Н.В. Нагорная, Н.А. Четверик //Здоровье ребенка. – 2010. – №2(23). – С. 140-145.
4. Романовская В.Н. Состояние системы гемостаза у крыс Вистар при оксидативном стрессе различной природы / В.Н. Романовская, А.Н. Старосельская, Л.П. Жаворонков // Бюлл. эксперим. биол. и мед. – 2012. – Т. 153. – № 3. – С. 286–289.
5. Васенина Е.Е. Окислительный стресс в патогенезе нейродегенеративных заболеваний: возможности терапии. / Е.Е. Васенина, О.С. Левин //Современная терапия в психиатрии и неврологии. – 2013. – №3-4. – С. 39–46.
6. Зозуля Ю.А. Свободнорадикальное окисление и антиоксидантная защита при патологии головного мозга / Ю.А. Зозуля, В.А. Барабой, Д.А. Сутковой. – М.: Знание-М., – 2000. – 9 с.
7. Болдырев А.А. Окислительный стресс и мозг / А.А. Болдырев // Соросовский образовательный журнал. – 2001. – том 7. – № 4. – С. 21-28.
8. Фролов Б.А. Физиология и патология нейроэндокринной регуляции. / Б.А. Фролов. – Москва, – Медицина. – 2006. – 320 с.
9. Оксидативный стресс и воспаление: патогенетическое партнерство: Монография / Под ред. О. Г. Хурцилавы, Н. Н. Плужникова, Я. А. Накатиса. — СПб.: Издательство СЗГМУ им. И. И. Мечникова, – 2012. – 340 с.
10. Девяткин А.А. Корреляция концентраций ферментов системы ПОЛ-АО в сыворотке крови и тканях печени крыс / А.А. Девяткин, П.В. Борискин, О.Н. Гуленко и др. // Международный научно-исследовательский журнал. – 2020. – № 7 (97), часть II, июль. – С. 15–20.
11. Арутюнян А.В. Методы оценки свободнорадикального окисления и антиоксидантной системы организма / А.В. Арутюнян, Е.Е. Дубинина, Н.Н. Зыбина. — СПб.: Фолиант, 2000. — 104 с.
12. Аджиев Д.Д. Основные параметры антиоксидатной системы крови кроликов в половозрастной динамике / Д.Д. Аджиев, Г.Ю. Мальцев, С.А. Румянцев, Е.Н. Маляренко, Н.Ф. Заторская // Сельскохозяйственная биология. – 2015. – том 50. – № 2. – С. 208-216.
13. Роговский В.С. Антигипертензивная и нейропротекторная активность кверцетина и его производных / В.С. Роговский, Н.Л. Шимановский, А.И. Матюшин // Журнал Экспериментальная и клиническая фармакология. – 2012. – Т. 75. – № 9. – С. 37–41.

Список литературы на английском языке / References in English

1. Kocur V.A. Oksidativnyj stress i antioksidantnaja zashhita organizma [Oxidative stress and antioxidant protection of an organism] / V.A. Kocur, D.F. Valiulina // Materialy XIII Mezhdunarodnoj nauchno-prakticheskoj konferencii. [Proceedings of XIII International Scientific-Practical Conference.] – Magnitogorsk: Publishing house of state .tehn.un-ta im. G.I. Nosova. – 2018. – P. 163-164. [in Russian]
2. Kurashvili V.A. Novye vozmozhnosti predotvrashhenija oksidativnogo stressa [New Opportunities for Prevention of Oxidative Stress] / V.A. Kurashvili, L. Majljem // Zhurnal natural'noj mediciny [Journal of Natural Medicine] – 2001. – № 1. – P. 7-14. [in Russian]
3. Nagornaja N.V. Oksidativnyj stress: vlijanie na organizm cheloveka, metody ocenki [Oxidative stress: impact on the human body, methods of evaluation] / N.V. Nagornaja, N.A. Chetverik //Zdorov'e rebenka [Child health]. – 2010. – №2(23). – P. 140-145. [in Russian]
4. Romanovskaja V.N. Sostojanie sistemy gemostaza u krys Vistar pri oksidativnom stresse razlichnoj prirody [The state of the hemostasis system in Wistar rats under oxidative stress of different nature] / V.N. Romanovskaja, A.N. Starosel'skaja, L.P. Zhavoronkov // Bjull. jeksperim. biol. i med. [Bulletin of experiments on biol and honey] – 2012. – Vol. 153. – № 3. – P. 286–289. [in Russian]
5. Vasenina E.E. Okislitel'nyj stress v patogeneze nejrodegenerativnyh zabolevanij: vozmozhnosti terapii [Oxidative stress in the pathogenesis of neurodegenerative diseases: therapy possibilities] / E.E. Vasenina, O.S. Levin //Sovremennaja terapija v psihiatrii i nevrologii [Modern therapy in psychiatry and neurology]. – 2013. – №3-4. – P. 39–46. [in Russian]
6. Zozulja Ju.A. Svobodnoradikal'noe okislenie i antioksidantnaja zashhita pri patologii golovnogo mozga [Free radical oxidation and antioxidant protection in case of the brain pathology] / Ju.A. Zozulja, V.A. Baraboj, D.A. Sutkovoj. – M.: Znanie-M., – 2000. – 9 p. [in Russian]
7. Boldyrev A.A. Okislitel'nyj stress i mozg [Oxidative stress and brain] / A.A. Boldyrev // Sorosovskij obrazovatel'nyj zhurnal [Soros educational journal]. – 2001. – vol. 7. – № 4. – P. 21-28. [in Russian]
8. Frolov B.A. Fiziologija i patologija nejrojendokrinnoj reguljacii [Physiology and pathology of neuroendocrine regulation] / B.A. Frolov. – Moscow, – Medicina. – 2006. – 320 p. [in Russian]
9. Oksidativnyj stress i vospalenie: patogeneticheskoe partnerstvo: Monografija [Oxidative stress and inflammation: pathogenetic partnership: Monograph] / Edit. by O. G. Hurcilavy, N. N. Pluzhnikova, Ja. A. Nakatisa. — SPb.: Publishing house of SZGMU im. I. I. Mechnikova, – 2012. – 340 p. [in Russian]
10. Devjatkin A.A. Korreljacija koncentracij fermentov sistemy POL-AO v syvorotke krovi i tkanjah pecheni krys [Correlation of concentration of enzymes of POL-AO system in blood serum and rat liver tissue] / A.A. Devjatkin, P.V. Boriskin, O.N. Gulenko et al // Mezhdunarodnyj nauchno-issledovatel'skij zhurnal [International research journa]. – 2020. – № 7 (97), chast' II, ijul'. – P. 15–20. [in Russian]
11. Arutjunjan A.V. Metody ocenki svobodnoradikal'nogo okislenija i antioksidantnoj sistemy organizma [Methods for Evaluating Free Radical Oxidation and Antioxidant System of the Body] / A.V. Arutjunjan, E.E. Dubinina, N.N. Zybina. – SPb.: Foliant, 2000. – 104 p. [in Russian]
12. Adzhiev D.D. Osnovnye parametry antioksidatnoj sistemy krovi krolikov v polovozrastnoj dinamike [The main parameters of the rabbit blood antioxidant system in the sex and age dynamics] / D.D. Adzhiev, G.Ju. Mal'cev, S.A. Rumjancev, E.N. Maljarenko, N.F. Zatorskaja // Sel'skohozjajstvennaja biologija [Agricultural biology] – 2015. – vol 50. – № 2. – P. 208-216. [in Russian]
13. Rogovskij V.S. Antigipertenzivnaja i nejroprotektornaja aktivnost' kvercetina i ego proizvodnyh [ntihypertensive and neuroprotective activity of quercetin and its derivatives]/ V.S. Rogovskij, N.L. Shimanovskij, A.I. Matjushin // Zhurnal Jeksperimental'naja i klinicheskaja farmakologija [Journal of Experimental and Clinical Pharmacology]. – 2012. – vol. 75. – № 9. – P. 37–41. [in Russian]