ОСОБЕННОСТИ МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНЫХ ПАРАМЕТРОВ ЭРИТРОЦИТОВ У ЗДОРОВЫХ ДЕВУШЕК С РАЗНЫМИ ГЕНОТИПАМИ I/D ПОЛИМОРФИЗМА ГЕНА АНГИОТЕНЗИН-ПРЕВРАЩАЮЩЕГО ФЕРМЕНТА

ОСОБЕННОСТИ МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНЫХ ПАРАМЕТРОВ ЭРИТРОЦИТОВ У ЗДОРОВЫХ ДЕВУШЕК С РАЗНЫМИ ГЕНОТИПАМИ I/D ПОЛИМОРФИЗМА ГЕНА АНГИОТЕНЗИН-ПРЕВРАЩАЮЩЕГО ФЕРМЕНТА

Научная статья

Антипина Т.В.^1, *, Галимьянова Л.К.², Хажиева Е.А.³, Шамратова В.Г.⁴

^{1, 2, 3, 4} Башкирский государственный университет, Уфа, Россия

* Корреспондирующий автор (antipina-tania[at]mail.ru)

Аннотация

Изучены особенности количественных и морфофункциональных характеристик эритроцитов, а также их взаимосвязей у обладателей разных генотипов инсерционно-делеционного J/D полиморфизма гена ангиотензин-превращающего фермента (АПФ). Установлены генотипические различия размеров эритроцитов, их наполненности гемоглобином, а также осмотической резистентности. При наличии в генотипе аллели J продемонстрирована связь между численностью эритроцитов,  гематокритом, при генотипе JJ  - содержанием гемоглобина и устойчивостью мембран эритроцитов.

Ключевые слова: ангиотензин-превращающий фермент, гемоглобин, гематокрит, осмотическая резистентность.

MAIN FEATURES OF MORPHOLOGICAL AND FUNCTIONAL PARAMETERS OF ERYTHROCYTES IN HEALTHY GIRLS WITH DIFFERENT I/D GENOTYPES OF GENE POLYMORPHISM OF ANGIOTENSIN-CONVERTING ENZYME

Research article

Antipina T.V.^1, *, Galimyanova L.K.², Khazhieva E.A.³, Shamratova V.G.⁴

^{1, 2, 3, 4} Bashkir State University, Ufa, Russia

* Корреспондирующий автор (antipina-tania[at]mail.ru)

Abstract

The main features of the quantitative morphological and functional characteristics of erythrocytes, as well as their relationships among the owners of different genotypes of the insertion-deletion J/D polymorphism gene of the angiotensin-converting enzyme (ACE), were studied. Genotypic differences in the size of erythrocytes, their fullness with hemoglobin, and osmotic resistance are established. In the presence of the J allele in the genotype, a connection was demonstrated between the number of erythrocytes, hematocrit with the JJ genotype, hemoglobin content and the stability of erythrocyte membranes.

Keywords: angiotensin-converting enzyme, hemoglobin, hematocrit, osmotic resistance.

Ген ангиотензин-превращающего фермента (АПФ) является важным физиологическим регулятором артериального давления и водно-солевого обмена. J/D полиморфизм гена АПФ влияет на метаболизм и гипертрофию скелетной мускулатуры в ответ на физические упражнения [5, С. 26], [1, C. 170]. АПФ отвечает за регулирование воспалительных реакций, эритропоэз и насыщение тканей кислородом [10, C. 22], [9, C. 79]. I аллель гена АПФ определяет оптимальный сосудистый тонус, преобладание медленных мышечных волокон, позволяет переносить кислородную недостаточность. Установленные многочисленными исследованиями связи J/D полиморфизма гена АПФ с различными показателями кардиореспираторной системы организма и спортивной успешностью свидетельствуют о вовлечении данных генов в регуляцию кислородтранспортной системы организма. Так, выносливость у лиц с аллелью I может быть связанна с увеличением кровотока в мышцах и энергетических ресурсов, повышенным транспортом кислорода, а также повышенным содержанием миоглобина в мышцах [3, C. 38], [2, C.88]. У юношей установлено влияние I/D полиморфизма гена АПФ на средний объем эритроцитов крови, однако оно проявляется только при высокой двигательной активности и не обнаруживается у физически малоактивных юношей. Этот факт расценивается как фактор адаптации организма к интенсивным двигательным нагрузкам в зависимости от состояния сосудистого тонуса у  обладателей разных генотипов [7, C. 77], [8, C. 78]. Поскольку параметры красной крови имеют четко выраженные гендерные различия, цель настоящей работы заключается в изучении связей функционального состояния эритроцитарного звена крови с генотипическими особенностями  девушек.

У 200 здоровых девушек - студенток  в возрасте  18 – 22 лет забиралась венозная кровь, которая использовалась для изучения морфофункциональных характеристик эритроцитов и для методики генотипирования. Количество эритроцитов (RBC), содержание гемоглобина (Hb), средний объем эритроцитов (МСV), среднее содержание Hb в отдельном эритроците (MCH), среднюю концентрацию Hb в клетке (MCHC)  определяли с помощью автоматического анализатора «Mindray BC-3600» производства «Mindray» (Китай). Осмотическую резистентность эритроцитов (ОРЭ) изучали путем определения оптической плотности растворов гемоглобина после разрушения эритроцитов в серии гипотонических растворов хлорида натрия в понижающейся концентрации от 0,8% до 0,1% [4, C. 67], [6, C. 15]. Процент гемолиза эритроцитов (X) вычисляли при различных разведениях хлорида натрия по формуле: X=(E0 /Emax)·100, где Е0 – экстинкция исследуемой пробы, Еmax – экстинкция, соответствующая 100% гемолизу, X – процент гемолиза. По результатам осмотического гемолиза строили эритрограммы и определяли значения концентрации NaCl, при которой разрушалось 50% (ОРЭ50) эритроцитов.

Полиморфизм генов изучали в лаборатории кафедры генетики БГПУ им. Акмуллы. Амплификация проводилась с помощью ПЦР на термоциклере «Терцик» производства компании «ДНК технология». Для этого использовалась реакционная смесь объемом 20 мкл, содержащая 1,5 мкл буфера (50 мМтрис-НСI, рН = 8,8; 15 мМ (NH₄)₂SO₄; 5 мМ МgCI₂; 0,01% твин – 20; 0,01% желатина); 0,1 мкл геномной ДНК; смесь dNTP (по 200 мкл каждого), 1 единицу Taq ДНК-полимеразы Termus aquaticus (производства фирмы «Cилекс», г. Москва) и по 10 пМ каждого из локус-специфичных олигонуклеотидных праймеров с определенной концентрацией в зависимости от амплифицируемого локуса.

Связи между параметрами эритроцитов изучали методом факторного анализа.

Результаты исследования

В соответствие с генотипической принадлежностью были сформированы три группы: лица, обладающие генотипом DD (80 человек),  JD (92 человека) и JJ (28 человек). В среднем все учтенные показатели в трех группах обследованных девушек колебались в границах нормы. На рис. 1 представлена гистограмма, отражающая варьирование  общего содержания гемоглобина в группах обследованных.

 

Рис. 1 – Содержание гемоглобина в крови девушек с разными генотипами J/D полиморфизма гена АПФ

 

Согласно проведенному исследованию, у обладателей генотипа DD концентрация гемоглобина ниже, чем у носителей аллеля J (JD и JJ), причем отличие достоверно по сравнению c генотипом JD. Общая численность эритроцитов в периферической крови и их общий объем (гематокрит)  не имели генотипических особенностей.

Изучение индивидуальных характеристик эритроцитов показало наличие значимых генотипических различий по объему отдельных клеток, содержанию в них гемоглобина, насыщенности клеток гемоглобином и величине анизоцитоза. На рис. 2 представлены размеры эритроцитов в группах обследованных девушек. Видно, что у носителей генотипа JJ объем эритроцитов ниже, чем у обладателей аллели D.

Рис. 2 – Средний объем эритроцитов в группе у девушек с разными генотипами J/D полиморфизма гена АПФ

 

Рис. 3 отражает концентрацию гемоглобина в отдельных эритроцитах. В противоположность объему клеток, их наполненность гемоглобином оказалась наиболее высокой у обладателей JJ генотипа. При сравнении среднего содержания и средней концентрации гемоглобина выяснилось, что эти показатели достоверно выше в группе девушек с JJ генотипом, чем у носителей DD генотипа гена АПФ.

Рис. 3 – Средняя концентрация гемоглобина в эритроцитах в крови у девушек с разными генотипами J/D полиморфизма гена АПФ

 

При гетерозиготном генотипе эритроциты имеют наиболее крупные размеры, а по содержанию и концентрации гемоглобина в отдельных клетках обладатели JD генотипа занимают промежуточное положение.

Сравнение осмотической резистентности эритроцитов в отдельных группах девушек проводили по величинам ОРЭ50, что соответствует устойчивости основной популяции зрелых эритроцитов (рис.4).

Рис. 4 – Осмотическая резистентность эритроцитов (ОРЭ 50) с разными генотипами J/D полиморфизма гена АПФ

 

Видно, что наименьшей устойчивостью эритроцитов отличаются обладатели генотипа DD. Выяснилось, что в этой группе резистентность популяции зрелых эритроцитов достоверно ниже, чем у носителей аллелей J (JD и  JJ). Что касается обладателей аллели J, то между ними не выявлено достоверных отличий показателей устойчивости эритроцитов.

Изучение взаимосвязей между учтенными параметрами крови у носителей разных генотипов проводилось методом факторного анализа. По матрицам данных обследованных девушек было выделено по два фактора, совместно описывающих 81%, 82% и 97%,  соответственно  при генотипах  DD, JD и  JJ (табл.).

 

Таблица 1 – Факторная структура показателей красной крови и осмотической резистентности эритроцитов девушек с разными генотипами

Показатели	Фактор 1			Фактор 2
генотипы	DD	JD	JJ	DD	JD	JJ
HGB	0,97		0,96		0,68
RBC		0,92	0,93
HCT	0,79	0,94	0,97
MCV	0,89				0,82	-0,77
MCH	0,87		0,97
MCHC				0,70		0,78
ОРЭ50		-0,78	-0,80
Дисперсия (%)	52	48	72	29	34	25

Примечание: указаны только достоверные корреляции переменных с фактором  

Анализ факторных структур позволил обнаружить некоторые генотипические особенности. Так, при генотипе DD не выявляются, а у обладателей аллели J четко прослеживаются связи количественных параметров красной крови (RBC и HCT) с функциональными характеристиками эритроцитов (осмотическая резистентность). Согласно структуре доминирующего фактора (с емкостью 48% и 72%), как при генотипе JD, так и  JJ увеличение общей численности эритроцитов и гематокрита сопровождается возрастанием их осмотической устойчивости (снижение концентрации соли, сопровождающееся их гемолизом). Возможно, повышенная резистентность основной популяции зрелых эритроцитов в кровеносном русле обеспечивает оптимальную для организма дыхательную поверхность красной крови. В то же время при носительстве JJ генотипа существенный вклад в дисперсию фактора вносит общая концентрация гемоглобина в крови и среднее содержание гемоглобина в эритроците:  повышение HGB и  MCH также сочетается с повышением устойчивости мембран эритроцитов к действию гемолитика.

Таким образом, у девушек - обладателей JJ генотипа гена АПФ средний объем эритроцитов ниже, а насыщенность гемоглобином и осмотическая резистентность выше, чем у носителей аллели D. Примечательно, что с осмотической устойчивостью эритроцитов взаимосвязаны не размеры отдельных клеток, а  при наличии в генотипе аллели J  - суммарные  количественные (при генотипе JJ и качественные) параметры красной крови.

Конфликт интересов Не указан.

Conflict of Interest None declared.

Список литературы / References

1. Аристова И.К. К вопросу о использовании полиморфизма гена ангиотензин-превращающего фермента (АСЕ) для определения предрасположенности к разным видам спорта / И.К. Аристова // Научные ведомости. – 2013. - №11. – С. 170 – 172.
2. Ахметов И.И. Использование молекулярно-генетических методов для прогноза аэробных и анаэробных возможностей у спортсменов / И.И. Ахметов // Физиология человека. – 2008. - №3. С. 86 – 91.
3. Бондарева Э. А. Ассоциация четырех полиморфных генетических систем (АСЕ, EPAS, ACTN3 и NOS3) со спортивной успешностью в борьбе самбо / Э. А. Бондарева // Вестник московского университета . – 2010. - №1. – С. 36 – 45.
4. Василевская Н.Л. Методика определения резистентности эритроцитов / Н.Л. Василевская // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. – 1995. - №12. - С. 67-72.
5. Ведяков А.М. Анализ полиморфизма генов АСЕ и BDKRB2 у спортсменов / А.М. Ведяков // Вестник спортивной науки. – 2006. - №1. – С. 32 – 36.
6. Горшкова М.А. Модификация метода определения осмотической резистентности эритроцитов / М.А. Горшкова // Тверской медицинский журнал. – 2017. - №3. – С. 12 – 17.
7. Даутова А.З. Влияние полиморфизмов генов АСЕ и BDRRB2 на показатели кислородтранспортной системы организма юношей в зависимости от уровня двигательной активности / А.З. Даутова // Вестник Адыгейского государственного университета. Сер. Естественно-математические и технические науки. – 2018. – №2. – С. 70 – 78.
8. Попушой А.А. Генетическая предрасположенность женской части коренного населения крайнего севера к сердечно-сосудистой патологии /А.А. Попушой // Проблемы женского здоровья. – 2013. - №1. – С. 12 – 17.
9. Реброва Т.Ю. I/D полиморфизм гена ангиотензинпревращающего фермента у больных ИБС разного пола и возраста / Т.Ю. Реброва // Кардиогенетика. – 2014. - №10. – С. 77 – 81.
10. Dias R. G. A. Genetic polymorphisms determining of the physical performance in elite athletes / R. G. A. Dias, A.d.C. Pereira, C. E. Negrao et. al. // Rev Bras Med Esporte. – 2007. – Vol. 13. – P. 20 – 24.

Список литературы на английском языке / References in English

1. Aristova I.K. K voprosu o ispol'zovanii polimorfizma gena angiotenzin-prevrashhajushhego fermenta (ASE) dlja opredelenija predraspolozhennosti k raznym vidam sporta [On the use of polymorphism of the angiotensin-converting enzyme gene (ACE) for determining susceptibility to different sports] / I.K. Aristova // Nauchnye vedomosti [Scientific statements]. – 2013. – №11. – P. 170 – 172.
2. Ahmetov I.I. Ispol'zovanie molekuljarno-geneticheskih metodov dlja prognoza ajerobnyh i anajerobnyh vozmozhnostej u sportsmenov [The use of molecular genetic methods for the prediction of aerobic and anaerobic abilities among athletes / I.I. Akhmetov] / I.I. Ahmetov // Fiziologija cheloveka [Human Physiology]. – 2008. – №3. – P. 86 – 91.
3. Bondareva Je. A. Associacija chetyreh polimorfnyh geneticheskih sistem (ASE, EPAS, ACTN3, NOS3) so sportivnoj uspeshnost'ju v bor'be sambo [Association of four polymorphic genetic systems (ACE, EPAS, ACTN3 and NOS3) with sports success in sambo wrestling] / Je. A. Bondareva // Vestnik moskovskogo universiteta [Moscow University Journal]. – 2010. – №1. – P. 36 – 45.
4. Vasilevskaja N.L. Metodika opredelenija rezistentnosti jeritrocitov [Method for determining erythrocyte resistance] / N.L. Vasilevskaja // Bjulleten' jeksperimental'noj biologii i mediciny [Journal of Experimental Biology and Medicine]. – 1995. – №12. - P. 67-72.
5. Vedjakov A.M. Analiz polimorfizma genov ASE, BDKRB2 u sportsmenov [Analysis of the polymorphism of the ACE and BDKRB2 genes in athletes] / A.M. Vedjakov // Vestnik sportivnoj nauki [Journal of Sports Science]. – 2006. – №1. – P. 32 – 36.
6. Gorshkova M.A. Modifikacija metoda opredelenija osmoticheskoj rezistentnosti jeritrocitov [Modification of the method for determining the osmotic resistance of erythrocytes] / M.A. Gorshkova // Tverskoj medicinskij zhurnal [Tver Medical Journal]. – 2017. – №3. – P. 12 – 17.
7. Dautova A.Z. Vlijanie polimorfizmov genov ASE i BDRRB2 na pokazateli kislorodtransportnoj sistemy organizma junoshej v zavisimosti ot urovnja dvigatel'noj aktivnosti [Influence of polymorphisms of the ACE and BDRRB2 genes on the indicators of the oxygen transport system of the body of young men depending on the level of motor activity] / A.Z. Dautova // Vestnik Adygejskogo gosudarstvennogo universiteta. Ser. Estestvenno-matematicheskie i tehnicheskie nauki [Journal of Adyghe State University. Ser. Natural-mathematical and technical sciences]. – 2018. – №2. – P. 70 – 78.
8. Popushoj A.A. Geneticheskaja predraspolozhennost' zhenskoj chasti korennogo naselenija krajnego severa k serdechno-sosudistoj patologii [Genetic predisposition of the female part of the indigenous population of the far north to cardiovascular pathology] /A.A. Popushoj // Problemy zhenskogo zdorov'ja [Problems of women's health]. – 2013. – №1. – P. 12 – 17.
9. Rebrova T.Ju. I/D polimorfizm gena angiotenzinprevrashhajushhego fermenta u bol'nyh IBS raznogo pola i vozrasta [I / D polymorphism of the angiotensin-converting enzyme gene in patients with coronary artery disease of different sex and age] / T.Ju. Rebrova // Kardiogenetika [Cardiogenetics]. – 2014. – №10. – P. 77 – 81.
10. Dias R. G. A. Genetic polymorphisms determining of the physical performance in elite athletes / R. G. A. Dias, A.d.C. Pereira, C. E. Negrao et. al. // Rev Bras Med Esporte. – 2007. – №13. – P. 20 – 24.