ИЗУЧЕНИЕ ГЕНА СOХ2 МТДНК СВИНЕЙ РАЗЛИЧНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ

ИЗУЧЕНИЕ ГЕНА СOХ2 МТДНК СВИНЕЙ РАЗЛИЧНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ

Научная статья

Колосова М.А.^1, *, Бакоев Н.Ф.², Колосов А.Ю.³, Гетманцева Л.В.⁴

¹ ORCID: 0000-0003-2979-7108;

² ORCID: 0000-0001-5495-8191;

³ ORCID: 0000-0002-6583-8942;

⁴ ORCID: 0000-0003-1868-3148;

^{1, 3} ФГБОУ ВО Донской государственный аграрный университет, пос.Персиановский, Россия;

^{2, 4} ФБНУ ФНЦ Всероссийский институт животноводства им. Л.К. Эрнста, Подольск, Россия

* Корреспондирующий автор (m.leonovaa[at]mail.ru)

Аннотация

Митохондрии иногда называют «клеточными электростанциями», потому что они производят большую часть питания клетки - аденозинтрифосфата (АТФ) - используемого в качестве источника химической энергии. В дополнение к генерации клеточной энергии, митохондрии участвуют и в ряде других процессов, таких как клеточная связь и дифференцировка, а также контроль клеточного цикла и роста клеток. Хотя большинство ДНК содержится в ядре клетки, митохондрии имеют свой собственный, независимый геном. Целью данного исследования стало изучение нуклеотидной последовательности гена COX2 и определение позиции гена в мтДНК свиней различных пород. В результате исследований были получены фрагменты митохондриального гена COX2 у свиней породы ландрас, крупной белой породы импортной и отечественной селекции разводимых в России. Позиция гена COX2 определена в интервале 8203..8890 п.н., размер гена составил 687 п.н. Проведен сравнительный анализ последовательности гена COX2 у свиней различных пород.

Ключевые слова: мтДНК, COX2, нуклеотидная последовательность, свиньи, позиция гена.

STUDY OF MITOCHONDRIAL COX2 DNA GENE OF PIGS OF DIFFERENT ORIGIN

Research article

Kolosova M.A.^1,*, Bakoev N.F.², Kolosov A.Yu.³, Getmantseva L.V.⁴

¹ ORCID: 0000-0003-2979-7108;

² ORCID: 0000-0001-5495-8191;

³ ORCID: 0000-0002-6583-8942;

⁴ ORCID: 0000-0003-1868-3148;

¹ Don State Agrarian University, Vil. Persianovsky, Russia

² FBSI FSC All-Russia Research Institute for Animal Husbandry, Podolsk, Russia

* Corresponding author (m.leonovaa[at]mail.ru)

Abstract

Mitochondria are sometimes called “cellular power stations” since they produce most of the nutrition of a cell, adenosine triphosphate (ATP) which is used as a source of chemical energy. In addition to generating cellular energy, mitochondria are involved in a number of other processes, such as cell communication and differentiation, as well as control of the cell cycle and cell growth. Although most DNA is found in the cell nucleus, mitochondria have their own, independent genome. This study is aimed at studying the nucleotide sequence of the COX2 gene and determining the position of mtDNA gene in of pigs of various breeds. As a result of the research, fragments of the mitochondrial COX2 gene were obtained from landrace breeds of pigs, a large white breed of imported and domestic breeding (raised in Russia). The position of the COX2 gene was determined in the interval 8203..8890 bps, the size of the gene was 687 bps. A comparative analysis of the sequence of the COX2 gene in pigs of various breeds was also carried out.

Keywords: mtDNA, COX2, nucleotide sequence, pigs, gene position. 

Митохондрии играют чрезвычайно важную роль в метаболических процессах, апоптозе и старении клеток. Полиморфизм, идентифицированный в митохондриальной ДНК, является одним из наиболее распространенных генетических маркеров, используемых в популяционных исследованиях многих видов животных. Это связано с высокой скоростью мутаций мтДНК и характером их наследования исключительно по материнской линии. И мужские и женские особи получают митохондрии из цитоплазмы материнской яйцеклетки. МтДНК не подвержена рекомбинации, поэтому вся молекула изменяется только путем мутирования на протяжении тысячелетий [1], [2].

МтДНК значительно меньше ядерной по размерам и кодирует всего несколько десятков биологических макромолекул. У свиней мтДНК представляет собой кольцевую молекулу, состоящую в среднем из 16,5 тыс. п.н. В состав мтДНК входят 37 генов: 13 для белков дыхательной цепи, 22 для тРНК и два рРНК (16S рРНК и 12S рРНК), а также наиболее вариабельная область - D-петля. Изменения, происходящие в мтДНК могут быть отражены в фенотипе. Результаты, полученные учеными, показали взаимосвязь между полиморфизмами как в геноме ядер и митохондрий, так и связь с продуктивными качествами разных видов животных.

 Цитохромная оксидаза (СOX) является незаменимым ферментом обнаруженным во всех организмах, которые выполняют аэробные дыхание. В своей активной форме в митохондриях млекопитающих, цитохромоксидаза представляет собой димерный фермент состоящий из двух мономеров, каждый из которых содержит 3 субъединицы (I-III), кодируемые митохондриальным геномом и 10, закодированные ядром [4]. Этот ген приобретает дополнительное значение в свете зависимости аэробного дыхания от функционирования COX2. В митохондриальном геноме большинство мутаций 1 класса  молчащие (третий кодон), тогда как мутации 2 класса  (первая и вторая позиции кодонов) приводят к аминокислотной замене. В генах, кодирующих митохондриальные белки, наблюдаемая частота замен намного выше для 1 класса, чем для сайтов 2 класса. Это справедливо для гена СОX2. Сайты 1 класса  накапливают замены быстрее, чем сайты 2 класса. Ген мтДНК COX2 является одним из элементов комплекса IV дыхательной цепи и, таким образом играет ключевую роль в производстве энергии [7]. Учитывая эту важную роль гена в клетках и относительно высокую степень внутривидовой изменчивости, идентификация полиморфизмов в митохондриальной ДНК свиней, в частности изучение нуклеотидной последовательности гена СОX2 имеет значение, так как мутации в этом гене могут быть связаны с экономически  важными признаками свиней.

Целью данного исследования стало изучение нуклеотидной последовательности гена COX2 и определение позиции гена в мтДНК свиней различных пород.

Материалы и методы исследований

Исследование нуклеотидной последовательности митохондриального гена СOX2 проводили на племенных свиньях породы ландрас (Л), крупная белая импортной селекции (КБ-и) и крупная белая отечественной селекции (КБ-о). Свиней породы ландрас в 2004 г. завезли из Дании и в дальнейшем разводили в условиях племенного предприятия РФ. Образцы ткани были отобраны в 2016 г. и помещены в биоколлекцию. Свиньи (КБ-и) были в 2013 г. завезены из Англии, образцы ткани были отобраны в 2014 г. и хранились в биоколлекции. Свиней (КБ-о) разводили в условиях племенного хозяйства до 2013 г., образцы были отобраны в 2011 г. Для исследования были взяты 12 образцов ткани (Л), 12 – (КБ-о) и 12 – (КБ-и). МтДНК выделяли набором «К-Сорб-100» (ООО «Синтол») в соответствии с инструкцией производителя. ПЦР проводили по стандартной методике. Визуализацию продуктов ПЦР проводили в 2% агарозном геле с добавлением бромистого этидия. Специфические фрагменты ПЦР выделяли из геля с использованием набора «Cleanup Mini» для очистки ДНК из геля (ЗАО «Евроген», Россия). Секвенирование фрагментов проводили в «ЗАО Евроген», Россия. Для редактирования и выравнивания последовательностей использовали программы BioEdit v7.2.6 и MEGA 7. В качестве референсной последовательности были взяты данные свиней породы ландрас, представленные в National Center for Biotechnological Information (NCBI) под номером NC_000845.1 (Sus scrofa). Для сравнительного анализа использовали данные свиней Large White, Duroc, Landerace, Meishan, Chinese Zhong Meishan, Luchuan, Chinese northeast wildboar, Swedish wild boar, Italian wild boar, Iberian, Chinese Yimenghei, Chinese Wuzhishan, Chinese Xiang, Chinese Zang, Mangalica and Mangalitsa swallow belly размещенные в международной базе NCBI (таблица).

Результаты исследований и их обсуждение

В результате изучения гена COX2 мтДНК у свиней различных пород определены позиции гена. Большинством исследователей установлено, что ген COX2 в митохондриальном геноме свиней расположен в пределах  8203..8890 п.н., что соответствует позиции гена в референсной последовательности свиней породы ландрас,  представленной в NCBI под номером NC_000845.1 (Sus scrofa) (таблица). Однако, у разных авторов встречаются некоторые расхождения относительно позиции гена COX2 у свиней принадлежащих к одной породе, так и различных пород. Небольшие смещения в позициях митохондриальных генов обусловлены тем, что общая длина зависит от тандемных повторов определенного участка мтДНК.

 

Таблица 1 – Позиции гена COX2 мтДНК у свиней различных пород

№ в базе NCBI	Порода	Позиция гена COХ2, п.н.
NC_000845.1	Референсная последовательность (Sus scrofa)	8203..8890
AF486874.1	Large White (Chinese)	6961..7656
AY574048.1	Large White (South Korea)	8129..8816
AF486858.1	Duroc (Chinese)	6962..7657
AF486866.1	Landerace (Chinese)	6962..7657
AF304200.1	Meishan (Chinese)	6962..7649
KM998967.1	Meishan (China)	8300..8987
JN601071.1	Meishan (USA)	7027..7722
AF486855.1	Zhong Meishan (Chinese)	6964..7659
KM275217	Luchuan (China)	8302..8989
EU333163.1	Northeast wildboar (Chinese)	8173..8860
AF304203.1	Wild boar (Swedish)	6961..7656
AF304201.1	Wild boar (Italian)	6963..7658
EU117375.1	Iberian (Spain)	7028..7723
AF486868.1	Yimenghei (Chinese)	6961..7656
AF486867.1	Wuzhishan (Chinese)	6962..7657
AF486859.1	Xiang (Chinese)	6963..7658
AF486856.1	Zang (Chinese)	6962..7657
KJ746666.1	Mangalica (Hungary)	8311..8998
JN601069.1	Mangalitsa swallow belly (USA)	7027..7722
MF183224.1	Swallow-belly Mangalica (Hungary)	7026..7713
-	Large White (UK)	8203..8890
-	Large White (Russia)	8203..8890
-	Landrace (Russia)	8203..8890

 

Для выбранной нами популяции свиней породы Large White (AF486874.1), Duroc (AF486858.1), Chinese Meishan (AF304200.1), Chinese Zhong Meishan (AF486855.1), Chinese Yimenghei (AF486868.1), Chinese Wuzhishan (AF486867.1), Chinese Xiang (AF486859.1), Chinese Zang (AF486856.1), а также представителей дикого кабана Swedish wild boar (AF304203.1), Italian wild boar (AF304201.1) характерна позиция гена в пределах 6961..7658 п.н. [10]. Сho, Park [6] у свиней крупной белой породы корейской селекции (AY574048.1) определили позицию гена в пределах 8129..8816 п.н., Ran and Chen [8] у свиней породы Meishan (KM998967.1) и  Luchuan (KM275217) китайской селекции позицию гена локализовали в пределах 8300..8987 и 8302..8989 п.н. соответственно. В работе Yang J. et al [10] у Chinese northeast wildboar (EU333163.1) позиция гена установлена в пределах 8173..8860 п.н. Cannon M.V. et al [5], Alves E. et al [3] у свиней Meishan (JN601071.1), Iberian (Spain) (EU117375.1), Mangalitsa swallow belly (USA) (JN601069.1) определили позицию в интервале 7027..7722 п.н., а так же у свиней Swallow-belly Mangalica (Hungary) (MF183224.1) в пределах 7026..7713 п.н.

В результате проведенных исследований были получены фрагменты митохондриального гена COX2 у свиней породы ландрас, крупной белой породы импортной и отечественной селекции разводимых в России. Анализируя полученные данные можно отметить, что в исследуемых выборках позиция гена COX2 определена в интервале 8203..8890 п.н., размер гена составил 687 п.н., что согласуется с полученными данными относительно референсной популяции.

Выводы

Анализ гена COX2 у свиней различных пород в базе NCBI позволил установить позицию гена в пределах 8203..8890 п.н. и размер 687-695 п.н., что соответствует референсной последовательности свиней,  представленной в NCBI под номером NC_000845.1 (Sus scrofa). В результате проведенных исследований получены фрагменты мтДНК гена COX2 у свиней породы ландрас, крупной белой породы импортной и отечественной селекции разводимых в России. Позиция гена COX2 определена в пределах 8203..8890 п.н., размер гена составил 687 п.н.

Финансирование Работа выполнена с использованием средств гранта Президента Российской Федерации для государственной поддержки молодых российских ученых – кандидатов наук (договор №МК-1443.2018.11).	Funding The work was carried out within the grant from the President of the Russian Federation for state support of young Russian scientists – PhDs (contract No. MK-1443.2018.11).
Конфликт интересов Не указан.	Conflict of Interest None declared.

Список литературы / References

1. Колосова М.А. Анализ нуклеотидной последовательности генов тРНК у свиней породы ландрас и крупная белая / М.А. Колосова, Л.В. Гетманцева, Н.Ф. Бакоев и др. // Свиноводство. 2018. № 5. С. 43-45.
2. Колосова М.А. Изучение гена ТРНК (LEU) митохондриальной ДНК свиней / М.А. Колосова, А.Ю. Колосов, К.А. Юлдашева и др. // Вестник Донского государственного аграрного университета. 2018. № 3-1 (29). С. 27-31.
3. Alves E. Variation in mtDNA Iberian breed [Electronic resource] / E. Alves, A.I. Fernandez, C. Ovilo and others // Mejora Genetica Animal. 2007 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/EU117375
4. Bertrand B. MtDNA COI‐COII marker and drone congregation area: An efficient method to establish and monitor honeybee (Apis mellifera L.) conservation centres / B. Bertrand, M. Alburaki, H. Legout and others // Mol Ecol Resour. – 2015. Vol. 15(3). – P. 673-683. doi: 10.1111/1755-0998.12339
5. Cannon M.V. Mitochondrial DNA sequence and phylogenetic evaluation of geographically disparate Sus scrofa breeds / M.V. Cannon, T.D. Brandebourg, M.C. Kohn and others // J. Anim. Biotechnol. – 2015. Vol. 26(1). – P. 17–28. doi: 10.1080 / 10495398.2013.875474.
6. Cho I.C. The complete sequence of mitochondrial DNA of Large White (Sus scrofa) [Electronic resource] / I.C. Cho, J.J. Park and J.T. Jeon // National Institute of Subtropical Agriculture. 2004. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/45826211
7. Liu G. & Zhou L. Population genetic structure and molecular diversity of the red swamp crayfish in China based on mtDNA COI gene sequences G. Liu & L. Zhou // Mitochondrial DNA Part A. – 2017. Vol. 28(6). – P. 860-866. doi: 10.1080/24701394.2016.1199022
8. Ran M. and Chen B. The complete sequence of the mitochondrial genome of Luchuan pig (SusScrofa) [Electronic resource] / Ran and B. Chen // Department of Animal Genetics and Breeding. College of Animal Science and Technology. 2014. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/699046396/
9. Torres A.G., Batlle E., Ribas de Pouplana L. Role of tRNA modifications in human diseases. A.G. Torres, E. Batlle, L. Ribas de Pouplana // J. Mol. Med. – 2014. Vol. 20(6). – P. 306-314. doi: 10.1016 / j.molmed.2014.01.008.
10. Yang J. Genetic diversity present within the near-complete mtDNA genome of 17 breeds of indigenous / J. Yang, J. Wang, J. Kijas and others// Chinese pigs. J. Hered., 2003. Vol. 94(5). – P. 381–385.

Список литературы на английском языке / References in English

1. Kolosova M.A. Analiz nukleotidnoj posledovatel'nosti genov tRNK u svinej porody landras i krupnaya belaya [Analysis of the nucleotide sequence of tRNA genes in landrace and large white breed pigs] / M.A. Kolosova, L.V. Getmanceva, N.F. Bakoev and others // Svinovodstvo. [Pig breeding] 2018. № 5. S. 43-45. [in Russian]
2. Kolosova M.A. Izuchenie gena tRNK (LEU) mitohondrial'noj DNK svinej [Study of the tRNA (LEU) gene of porcine mitochondrial DNA]/ M.A. Kolosova, A.YU. Kolosov, K.A. Yuldasheva and others // Vestnik Donskogo gosudarstvennogo agrarnogo universiteta. [Bulletin of the Don State Agrarian University] 2018. № 3-1 (29). S. 27-31. [in Russian]
3. Alves E. Variation in mtDNA Iberian breed [Electronic resource] / E. Alves, A.I. Fernandez, C. Ovilo and others // Mejora Genetica Animal. 2007 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/EU117375
4. Bertrand B. MtDNA COI‐COII marker and drone congregation area: An efficient method to establish and monitor honeybee (Apis mellifera L.) conservation centres / B. Bertrand, M. Alburaki, H. Legout and others // Mol Ecol Resour. – 2015. Vol. 15(3). – P. 673-683. doi: 10.1111/1755-0998.12339
5. Cannon M.V. Mitochondrial DNA sequence and phylogenetic evaluation of geographically disparate Sus scrofa breeds / M.V. Cannon, T.D. Brandebourg, M.C. Kohn and others // J. Anim. Biotechnol. – 2015. Vol. 26(1). – P. 17–28. doi: 10.1080 / 10495398.2013.875474.
6. Cho I.C. The complete sequence of mitochondrial DNA of Large White (Sus scrofa) [Electronic resource] / I.C. Cho, J.J. Park and J.T. Jeon // National Institute of Subtropical Agriculture. 2004. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/45826211
7. Liu G. & Zhou L. Population genetic structure and molecular diversity of the red swamp crayfish in China based on mtDNA COI gene sequences G. Liu & L. Zhou // Mitochondrial DNA Part A. – 2017. Vol. 28(6). – P. 860-866. doi: 10.1080/24701394.2016.1199022
8. Ran M. and Chen B. The complete sequence of the mitochondrial genome of Luchuan pig (SusScrofa) [Electronic resource] / M. Ran and B. Chen // Department of Animal Genetics and Breeding. College of Animal Science and Technology. 2014. https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/699046396/
9. Torres A.G., Batlle E., Ribas de Pouplana L. Role of tRNA modifications in human diseases. A.G. Torres, E. Batlle, L. Ribas de Pouplana // J. Mol. Med. – 2014. Vol. 20(6). – P. 306-314. doi: 10.1016 / j.molmed.2014.01.008.
10. Yang J. Genetic diversity present within the near-complete mtDNA genome of 17 breeds of indigenous / J. Yang, J. Wang, J. Kijas and others// Chinese pigs. J. Hered., 2003. Vol. 94(5). – P. 381–385.