АДАПТАЦИОННЫЕ РЕАКЦИИ ЭРИТРОЦИТОВ И ПОЛИМОРФНОЯДЕРНЫХ ЛЕЙКОЦИТОВ CYPRINUS CARPIO НА ДЕЙСТВИЕ ТЕМПЕРАТУРНОГО ФАКТОРА

Чернявских С.Д.¹, До Хыу Кует ², Рыжкова Ю.П.³

¹ORCID: 0000-0003-1990-2082, кандидат биологических наук, доцент, ²ORCID: 0000-0002-3901-7366, аспирант, ³ORCID: 0000-0002-0086-3039, кандидат биологических наук,

Белгородский государственный национальный исследовательский университет, г. Белгород

АДАПТАЦИОННЫЕ РЕАКЦИИ ЭРИТРОЦИТОВ И ПОЛИМОРФНОЯДЕРНЫХ ЛЕЙКОЦИТОВ CYPRINUS CARPIO НА ДЕЙСТВИЕ ТЕМПЕРАТУРНОГО ФАКТОРА

Аннотация

В опытах in vitro изучены адаптационные реакции эритроцитов и полиморфноядерных лейкоцитов сазана Cyprinus carpio, инкубированных при разных температурных режимах, по изменению их морфометрических параметров и физических свойств плазматической мембраны методом атомно-силовой микроскопии (АСМ). Установлено, что вне зависимости от температуры инкубации красные клетки крови сазана сохраняют овальную или эллиптическую форму, белые клетки крови – округлой формы. Поверхность лейкоцитов Cyprinus carpio при контрольной (20^оС), пониженной (5^оС) и повышенной (40^оС) температурах инкубации имеет шероховатый вид. Установлено уменьшение морфометрических параметров полиморфноядерных лейкоцитов (площадь, объем, большой и малый диаметры) при снижении температуры инкубации до 5^оС по сравнению с температурой 20^оС. Упруго-эластические свойства эритроцитов и ПМЯЛ Cyprinus carpio как при снижении (до 5^оС), так и при повышении (до 40^оС) температуры инкубации, по сравнению с комнатной температурой (20^оС), уменьшаются.

Ключевые слова: эритроциты, полиморфноядерные лейкоциты, плазматическая мембрана, АСМ, температура.

 

Chernyavskikh S.D.¹, Do Khyu Kuet ², Ryzhkova Yu.P.³

¹ORCID: 0000-0003-1990-2082, PhD in Biology, Associate professor,

²ORCID: 0000-0002-3901-7366, Postgraduate student,

³ORCID: 0000-0002-0086-3039, PhD in Biology,

Belgorod State National Research University, Belgorod

ADAPTIVE RESPONCES OF ERYTHROCYTES AND POLYMORPHONUCLEAR LEUKOCYTES CYPRINUS CARPIO ON ACTION OF TEMPERATURE FACTOR

Abstract

Adaptive responces of erythrocytes and polymorphonuclear leucocytes of Cyprinus carpio carp, incubated under different temperature modes, by the change in their morphometric parameters and physical properties of the plasma membrane by atomic force microscope (AFM) investigation were studied in in vitro experiments. It was established that, regardless of the incubation temperature, the red cells of the carp“s blood preserve an oval or elliptical shape, white blood cells of a rounded shape. Surface of Cyprinus carpio leukocytes at control (20°C), lowered (5°C) and elevated (40°C) incubation temperatures has a rough appearance. A decrease in the morphometric parameters of polymorphonuclear leukocytes (area, volume, large and small diameters) was established with a decrease in the incubation temperature to 5°C in comparison with the temperature of 20°C. Elastic properties of erythrocytes and Cyprinus carpio PMLs both at decrease (up to 5°C) and at the increase of incubation temperature (up to 40°C), as compared with room temperature (20°C), decrease.

Keywords: erythrocytes, polymorphonuclear leukocytes, plasma membrane, AFM, temperature.

Проблема влияния температурного фактора на организм рыб является достаточно хорошо изученной [1], [2], [4], [5], [9], [10]. Однако остаются не исследованными ключевые механизмы адаптационных реакций гемоцитов у представителей надкласса Рыбы на действие холодовой и тепловой нагрузки. Так, требуют исследований реактивность физиологических параметров плазматической мембраны, тесно связанная с геометрическими показателями и физическими свойствами гемоцитов рыб, изменяющаяся при действии различных температур.

Целью данной работы было изучение адаптационных реакций плазмалеммы эритроцитов и полиморфноядерных лейкоцитов Cyprinus carpio на действие температурного фактора.

В качестве объектов изучения использовали эритроциты и полиморфноядерные лейкоциты (ПМЯЛ) периферической крови сазана, взятой из хвостовой вены. В качестве антикоагулянта применяли гепарин в отношении 10 ед. на 1 мл крови. После добавления гепарина проводили центрифугирование крови продолжительностью 10 мин. и относительной силе центрифугирования 400g. Суспензии эритроцитов и лейкоцитов разбавляли изотоническим раствором NaCl, концентрация которого составляла 0.6% [3]. Инкубация гемоцитов была проведена в условиях комнатной (20^оС), пониженной (5^оС) и повышенной (40^оС) температур (т^оС). Продолжительность инкубации для каждой пробоподготовки составляла 2 часа. Температуру 20^оС рассматривали как контрольную, т.к. в условиях умеренного климата данная температура оптимально приемлема для жизнедеятельности изучаемого вида рыб. Температуры 5^оС и 40^оС для инкубации эритроцитов и лейкоцитов сазана были выбраны в соответствии с верхней и нижней границами жизнедеятельности Cyprinus carpio [2], [6]. Данные температуры рассматривали как холодовую (5^оС) и тепловую (40^оС) нагрузки. После инкубации клеток были сделаны мазки крови.

На полученных мазках методом атомно-силовой микроскопии было исследовано по 20-25 клеток из каждой серии пробоподготовки. Для получения сканов был использован атомно-силовой микроскоп ИНТЕГРА Вита с программным обеспечением NT MDT SPM Software – Nova 1.0.26. Морфометрические параметры клеток исследованы в режиме полуконтактного сканирования [8], упруго-эластические и адгезионные свойства плазмалеммы − в режиме контактного сканирования, частота развертки составляла 0,6-0,8 Hz. Для сканирования был использован кантилевер серии NSG03 с жесткостью 1,4 Н/м и радиусом закругления 10 нм [9]. На полученных сканах измеряли большой (D, мкм) и малый (d, мкм) диаметры клеток, рассчитывали их площади поверхности (S, мкм ²) и объем (V, мкм ³). Показатели, характеризующие упругость плазмалеммы и способность клеток к адгезии, получали в режиме атомно-силовой спектроскопии при наложении нагрузки в 10 локальных участках клеточной поверхности. Полученные «силовые кривые» обрабатывали с помощью программы «Еf3».

Полученные данные представлены значениями средней арифметической выборочной совокупности (M), стандартным отклонением (среднее квадратическое отклонение, SD). Оценку различий непараметрических выборок проводили с помощью U-критерия Уилкоксон-Манна-Уитни (*, р < 0,05), параметрических выборок − с помощью t-критерия Стьюдента (*, р < 0,05). Вся статистическая обработка была проведена с использованием программы IBM SPSS Statistics 20.

На рисунке 1 представлены сканы эритроцитов сазана, полученные при разных температурных режимах инкубации. Установлено, что как при тепловой, так и при холодовой нагрузках красные клетки крови Cyprinus carpio сохраняют овальную или эллиптическую форму, их поверхность в зоне ядра является выпуклой.

Рис. 1 – Сканы красных клеток крови сазана, полученные при температурах инкубации: а – 5^оС, б – 20^оС, в – 40^оС

На АСМ-сканах лейкоцитов изученного вида рыб (рис. 2) выявлено, что температура инкубации не влияет на форму и шероховатость поверхности белых клеток крови сазана. Так, при температурах 5^оС, 20^оС и 40^оС ПМЯЛ Cyprinus carpio округлой формы, их поверхность имеет шероховатый вид.

Рис. 2 – Сканы ПМЯЛ сазана, полученные при температурах инкубации: а – 5оС, б – 20оС (указан стрелкой), в – 40оС

Геометрические параметры эритроцитов и лейкоцитов Cyprinus carpio, которые были получены при разных температурных условиях инкубации, занесены в таблицу 1.

Таблица 1 – Геометрические параметры клеток крови Cyprinus carpio после инкубации при разных температурах

Геометрические параметры	Типы клеток	Температура, оС
		5oC	20oC	40oC
S, мкм2	Э	74,6 ± 6,8	70,9 ± 3,0	71,8 ± 5,1
	ПМЯЛ	67,9 ± 8,6*	109,5 ± 14,3	107,7 ± 17,7
V, мкм3	Э	81,7 ± 5,3	76,8 ± 6,7	78,1 ± 9,1
	ПМЯЛ	59,5 ± 13,5*	102,6 ± 12,5	99,0 ± 17,7
D, мкм	Э	11,3 ± 0,7	11,0 ± 0,5	10,8 ± 0,4
	ПМЯЛ	9,5 ± 0,7*	12,5 ± 0,4	12,6 ± 0,9
d, мкм	Э	8,1 ± 0,8	8,3 ± 0,3	8,6 ± 0,6
	ПМЯЛ	8,5 ± 0,4*	11,3 ± 0,3	10,8 ± 0,4

Примечание: Э – эритроциты; ПМЯЛ – полиморфноядерные лейкоциты; S – площадь, V – объем, D – большой диаметр, d – малый диаметр; * – достоверные различия в сравнении с температурой 20^оС при р <0,05 (по U-критерию Уилкоксон-Манна-Уитни)

Согласно полученным результатам, достоверной разницы между изученными геометрическими данными красных клеток крови Cyprinus carpio у опытных групп по сравнению с контрольной не установлено.

У лейкоцитов сазана площадь, объем, большой и малый диаметры при холодовой нагрузке по сравнению с контролем уменьшаются на 40%, 42%, 24% и 25% соответственно. При тепловой нагрузке достоверных различий с контрольной группой по геометрическим показателям у лейкоцитов сазана не отмечается.

Результаты адгезии и модуля Юнга, характеризующие упруго-эластические и адгезионные свойства плазмалеммы красных и белых клеток сазана, полученные в условиях разных температур инкубации, представлены в таблице 2.

Таблица 2 – Показатели адгезии и модуля Юнга гемоцитов у Cyprinus carpio при действии температурного фактора

Показатели, ед. изм.	Типы клеток	Температура, оС
		5oC	20oC	40oC
Адгезия, нН	Э	17,7 ± 4,5*	34,6 ± 9,3	23,4 ± 5,8*
	ПМЯЛ	17,6 ± 2,7*	23,2 ± 4,1	22,8 ± 7,0
Модуль Юнга, кПа	Э	56,4 ± 1,8*	59,1 ± 1,7	54,3 ± 1,3*
	ПМЯЛ	57,5 ± 2,0*	60,9 ± 2,0	56,9 ± 2,4*

Примечание: Э – эритроциты, ПМЯЛ – полиморфноядерные лейкоциты; * – достоверные различия в сравнении с температурой 20^оС при р <0,05 (по t-критерию Стьюдента)

Согласно полученным данным, для эритроцитов сазана при холодовой и тепловой нагрузках характерно уменьшение адгезии клеток на 49% и 32% по сравнению с контролем. Адгезионный показатель у лейкоцитов ниже, чем в контроле (на 24%) только при холодовой нагрузке.

Показатели модуля Юнга у гемоцитов сазана уменьшаются как при холодовой, так и при тепловой нагрузках. Так, у красных клеток крови показатель упругости уменьшился на 5% и 8%, у белых – на 6% и 7% соответственно по сравнению с контролем.

Таким образом, методом АСМ изучено влияние температуры инкубации на морфометрические (геометрические) и физические показатели гемоцитов сазана.

При тепловой (40^оС) и холодовой (5^оС) нагрузках эритроциты Cyprinus carpio сохраняют овальную или эллиптическую форму, лейкоциты – округлой формы. При этом поверхность ПМЯЛ сазана при всех изученных температурных режимах инкубации имеет шероховатый вид.

Геометрические показатели эритроцитов сазана как при холодовой, так и при тепловой нагрузках, по сравнению с контролем, практически не изменяются. У ПМЯЛ сазана геометрические параметры при тепловой нагрузке также не изменяются, а при холодовой – уменьшаются.

Для показателей, характеризующих упруго-эластические свойства гемоцитов сазана, характерно уменьшение как при холодовой, так и при тепловой нагрузках. Известно, что в условиях повышения и снижения температуры инкубации, вместе с изменением регуляции микровязкости билипидного слоя плазмалеммы и фазового распределения в ней липидов, изменяется структурная композиция прилегающих к мембране белков и их взаимодействие с липидами, что неизбежно отражается на её свойствах [10]. В свою очередь, снижение упругости ведет к увеличению жесткости плазматической мембраны [7], что уменьшает функциональную активность клеток.

Список литературы / References

1. Голованов В. К. Эколого-физиологические закономерности распределения и поведения пресноводных рыб в термоградиентных условиях / В. К. Голованов // Вопросы ихтиологии. - 2013. - Т. 53(3). - С. 286-314.
2. Голованов В. К. Экспериментальная оценка верхней температурной границы жизнеобитания у молоди пресноводных видов рыб / В. К. Голованов // Труды Мордовского государственного природного заповедника имени П.Г. Смидовича. Саранск, Пушта. - 2013. - Вып. XI. - С. 125-132.
3. Иванов А. А. Физиология рыб / А. А. Иванов. - М.: Мир, 2003. - 284 с.
4. Исаев Р. А. Рост прудовых рыб в поликультуре в зависимости от температуры воды и концентрации кислорода / Р. А. Исаев, В. П. Кулаченко, Н. Н. Манько и др. // Инновационные пути развития АПК на современном этапе: материалы XVI международной научно-производственной конференции. - Белгород, 2012. - С. 69.
5. Кулаченко В. П. Физиологическое состояние и сохранность сеголетков карпа при содержании зимой в аквариумах / В. П. Кулаченко, И.В. Кулаченко, Р.А. Исаев и др. // Рыбное хозяйство. - 2013. - Т. 6. - С. 68-92.
6. Никольский Г. В. Экология рыб / Г. В. Никольский. – М.: Высшая школа, 1963. – 368 с.
7. Скоркина М. Ю. Морфофизиологический анализ механизмов регуляции объема клеток крови: автореферат дис. … д-ра биол. наук. Астрахань, 2014. - 40 с.
8. Федоpова М. З. Использование атомно-силовой микроскопии для оценки морфометрических показателей клеток крови / М. З. Федоpова, Н. А.Павлов, Е. В. Зубаpева и др. // Биофизика. - 2008. - Т. 53. - № 6. - С. 555-559.
9. Чернявских С.Д. Миграционная активность гемоцитов позвоночных животных при различной температуре / С. Д. Чернявских, М. З. Федорова, Д. Х. Кует // Научные ведомости БелГУ. Сер. «Естественные науки». - 2011. - №3 (98). - Вып. 14. - С. 150-154.
10. Чернявских С. Д. Сезонные колебания относительной микровязкости, полярности и сорбционной способности эритроцитарных мембран Cyprinus carpio и Rana ridibunda / С. Д. Черняских, С. В. Недопекина // Научные ведомости БелГУ. Сер. «Естественные науки». - 2013. - №3 (146). - Вып. 22. - С. 99-103.

Список литературы на английском языке / References in English

1. Golovanov V. K. Jekologo-fiziologicheskie zakonomernosti raspredelenija i povedenija presnovodnyh ryb v termogradientnyh uslovijah [Ecological and physiological patterns of distribution and behavior of freshwater fish in thermogradient conditions] / V. K. Golovanov // Voprosy ihtiologii [Ichthyology]. - 2013. - T. 53(3). – P. 286-314. [In Russian]
2. Golovanov V. K. Jeksperimental'naja ocenka verhnej temperaturnoj granicy zhizneobitanija u molodi presnovodnyh vidov ryb [Experimental evaluation of the upper temperature boundary of life in freshwater fish juveniles] / V. K. Golovanov // Trudy Mordovskogo gosudarstvennogo prirodnogo zapovednika imeni P.G. Smidovicha. Saransk, Pushta [Proceedings of the Mordovian State Nature Reserve named after P.G. Smidovich. Saransk, Pushta]. - 2013. - Issue XI. – P. 125-132. [In Russian]
3. Ivanov A. A. Fiziologija ryb [Physiology of fishes] / A. A. Ivanov. - M.: World, 2003. - 284 p. [In Russian]
4. Isaev R.A. Rost prudovyh ryb v polikul'ture v zavisimosti ot temperatury vody i koncentracii kisloroda [Growth of pond fishes in polyculture depending on water temperature and concentration of oxygen] / R.A. Isaev, V.P. Kulachenko, N.N. Manko and others // Innovacionnye puti razvitija APK na sovremennom jetape: materialy XVI mezhdunarodnoj nauchno-proizvodstvennoj konferencii [Innovative ways of development of agrarian and industrial complex at the present stage: materials XVI of the international research and production conference]. - Belgorod, 2012. – P. 69. [In Russian]
5. Kulachenko V. P. Fiziologicheskoe sostojanie i sohrannost' segoletkov karpa pri soderzhanii zimoj v akvariumah [Physiological condition and safety of fingerlings of a carp at contents in the winter in aquariums] / V.P. Kulachenko, I. V. Kulachenko, R. A. Isaev and others // Rybnoe hozjajstvo [Fishery]. - 2013. - T. 6. – P. 68-92. [In Russian]
6. Nikolsky G. V. Jekologija ryb [Ecology of fishes] / G.V. Nikolsky. – M.: The higher school, 1963. – 368 p. [In Russian]
7. Skorkina M. Yu. Morfofiziologicheskij analiz mehanizmov reguljacii ob#ema kletok krovi [Morpho-physiological analysis of mechanisms of regulation of volume of blood cells: abstract yew. … PhD in Biology]. Astrakhan, 2014. - 40 p. [In Russian]
8. Fedorova M. Z. Ispol'zovanie atomno-silovoj mikroskopii dlja ocenki morfometricheskih pokazatelej kletok krovi [Use of atomic and power microscopy for assessment of morphometric indicators of blood cells] / M.Z. Fedorova, N.A. Pavlov, E.V. Zubareva and others // Biofizika [Biophysics]. - 2008. - T. 53. - №. 6. – P. 555-559. [In Russian]
9. Chernyavsky S.D. Migracionnaja aktivnost' gemocitov pozvonochnyh zhivotnyh pri razlichnoj temperature [Migration activity of gemotsit of vertebrate animals at various temperature] / S.D. Chernyavsky, M.Z. Fedorov, D.H. Kuyet and others // Nauchnye vedomosti BelGU. Ser. «Estestvennye nauki» [Scientific sheets of BELGU. It is gray. "Natural sciences"]. - 2011. - №. 3 (98). - Issue 14. – P. 150-154. [In Russian]
10. Chernyavsky S. D. Sezonnye kolebanija otnositel'noj mikrovjazkosti, poljarnosti i sorbcionnoj sposobnosti jeritrocitarnyh membran Cyprinus carpio i Rana ridibunda [Seasonal fluctuations of relative microviscosity, polarity and sorption ability eritrotsitarnykh of membranes of Cyprinus carpio and Rana ridibunda] / S.D. Chernyaskikh, S.V. Nedopekina // Nauchnye vedomosti BelGU. Ser. «Estestvennye nauki» [Scientific sheets of BELGU. It is gray. "Natural sciences"]. - 2013. - №. 3 (146). - Issue 22. – P. 99-103. [In Russian]