МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ АМИНОКИСЛОТ, ОБРАЗУЮЩИХСЯ В ЦИКЛЕ МОЧЕВИНЫ

Черноносов А.А.¹, Касакин М.Ф.², Коваль В.В.³

¹ ORCID: 0000-0001-8362-2443, кандидат химических наук, ² ORCID: 0000-0003-0069-0040, ³ ORCID: 0000-0002-2577-2184, кандидат химических наук, Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

Работа выполнена при поддержке программы Сибирского отделения РАН (III.2П.1). Проект 2.1.26 "Масс-спектрометрический анализ аминокислот и ацилкарнитинов, образующихся в цикле мочевины"

МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ АМИНОКИСЛОТ, ОБРАЗУЮЩИХСЯ В ЦИКЛЕ МОЧЕВИНЫ

Аннотация

В работе получено распределение концентраций аминокислот, образующихся в цикле мочевины - аргинина, цитруллина, орнитина и аспарагиновой кислоты и определен диапазон их нормальных значений в Российской популяции на примере жителей Западно-Сибирского региона России.

Ключевые слова: масс-спектрометрия, цикл мочевины, аргинин, цитруллин, орнитин, аспарагиновая кислота.

 

Chernonosov A.A.¹, Kasakin M.F.², Koval V.V. ³

¹ ORCID: 0000-0001-8362-2443, PhD in Chemistry, ² ORCID: 0000-0003-0069-0040, ³ ORCID: 0000-0002-2577-2184, PhD in Chemistry, Institute of Chemical Biology and Fundamental Medicine SB RAS

MASS SPECTROMETRY ANALYSIS OF AMINO ACIDS FORMING IN THE UREA CYCLE

Abstract

In the article the concentration distribution of amino acids, which are formed in the urea cycle, - arginine, citrulline, ornithine, aspartic acid, were obtained. The normal values range of these amino acids was determined in the Russian population on the example the inhabitants of the West Siberian region of the Russia.

Keywords: mass spectrometry, urea cycle, arginine, citrulline, ornithine, aspartic acid.

Аминокислоты аргинин (Arg), цитруллин (Cit), орнитин (Orn) и аспарагиновая кислота (Asp) являются участниками биохимических реакций, составляющих цикл мочевины. Важность цикла мочевины обусловлена потребностью млекопитающих выводить из организма высокие концентрации аммиака, который образуется в больших количествах в результате метаболизма. Нарушения в цикле мочевины выражается изменением уровня аминокислот, возникающих из-за нарушения работы соответствующих ферментов [1, 2]. Как правило, это наследственные заболевания, которые в странах Европы [3], Японии и США [4], определяются в ходе проведения неонатального скрининга – анализа, позволяющего методом масс-спектрометрии выявить около 40 различных наследственных заболеваний.

В России с начала 90-х годов обязательным на всей территории было проведение скрининг-теста только на фенилкетонурию и врожденный гипотиреоз (ВГ). С 2006 года к этим двум заболеваниям добавилась ещё диагностика и таких заболеваний, как адреногенитальный синдром, галактоземия и муковисцидоз. Вследствие того, что анализ аминокислот, участвующих в цикле мочевины, для новорожденных в России не проводится, нарушения выявляются в более старшем возрасте. Нормальные значения уровня аминокислот, используемые в настоящее время, как правило, определены для новорожденных и для жителей стран Европы, Японии и США. Поэтому возникает необходимость определить нормы аминокислот, участвующих в цикле мочевины, для детей старшего возраста проживающих на территории России.

Целью настоящего исследования являлось определение уровней Arg, Cit, Orn и Asp по анализу сухих пятен крови методом ESI-MS/MS, и расчет нормальных значений данных параметров, характерных для российской популяции на примере жителей Западно-Сибирского региона РФ.

Материалы и методы

В работе использовались ацетонитрил LC-MS Grade (Panreac, Испания), набор внутренних стандартов и растворы для проведения анализа из набора MassChrom® Amino Acids and Acylcarnitines from dried blood - LC-MS/MS (Chromsystems Instruments & Chemicals GmbH., Германия), специальная бумага Whatman 903 Protein Saver Card (GE Healthcare, США).

Из поступивших сухих образцов крови на бумаге Whatman 903 Protein Saver Card (GE Healthcare, США) вырезали диск диаметром 3,2 мм из полностью пропитанной кровью области, который помещали в отдельную 1,5 мл пробирку. В пробирку с диском добавляли 200 мкл рабочего раствора внутренних стандартов аминокислот. Далее проводили экстракцию аминокислот из анализируемых образцов в рабочий раствор, содержащий внутренние стандарты аминокислот. Для этого пробирки помещали в термостат и инкубировали в течение 30 минут при 25 °С при постоянном перемешивании с частотой 600 оборотов в минуту. Супернатант переносили в чистые пробирки, раствор аминокислот упаривали досуха в концентраторе CentriVap (Labconco, США) в течение 40-45 минут при 56 °С. После чего проводили дериватизацию аминокислот, переводя их в бутиловые эфиры. Для этого к сухому остатку добавляли 150 мкл раствора бутанол: концентрированная соляная кислота = 7:3 (v/v), пробирки помещали в термостат и инкубировали в течение 15 минут при 56 °С при постоянном перемешивании с частотой 400 оборотов в минуту. Далее раствор бутиловых эфиров аминокислот, полученных в процесс дериватизации, упаривали до полного высыхания в концентраторе CentriVap в течение 40-45 минут при 56 °С. Сухой остаток растворяли в 100 мкл 80% ацетонитрила.

Определение концентрации аминокислот проводили с использованием масс-спектрометра Agilent 6410 QQQ (Agilent Technologies). Анализируемые растворы переносили в виалы объемом 300 мкл, которые помещали в 56-ти луночный планшет. С помощью программного комплекса Masshunter фирмы Agilent Technologies задавали параметры анализа: объем аликвоты (10 мкл), скорость потока элюента (0,1 мл/мин, 50% ацетонитрил), время анализа (2 мин), моду измерения (положительная), режим измерения – режим множественных реакций (MRM). Устанавливали параметры электроспрей ионизации: температуру газа 300 °С, поток газа 7 л/мин, давление в небулайзере 20 psi, напряжение на капилляре 3500 В. После каждого анализа в программе MassHunter автоматически проводили количественный расчет, основываясь на данных для внутренних стандартов. После окончания процедуры расчета и выдачи отчета, проводили обработку и анализ данных.

Статистическая обработка проведена с помощью программ Microsoft Excel и Origin использованием параметрического метода: определены среднее значение - Х, стандартное отклонение - δ, 95% доверительный интервал для значений – Х ± 2δ, медиана – Ме и для сравнения с литературными данными - разброс (2,5-97,5 процентили).

Результаты и обсуждения

В исследование приняли участие 652 пациента, обращавшихся в клиники г. Новосибирска для определения уровня аминокислот и ацилкарнитинов. Средний возраст пациентов составил 5,8 лет, минимальный 1 год, максимальный 18 лет. Пациентов мужского пола было 428 человек, женского – 224 человек. Пациенты сдавали кровь в медицинских учреждениях путем пропитывания кровью бумаги Whatman 903 Protein Saver Card (GE Healthcare, США). Образцы крови высушивали и передавали в ИХБФМ СО РАН для масс-спектроскопического анализа. Исследование проведено с соблюдением протокола, утвержденного комитетом на заседании локального комитета по медицинской этике ИХБФМ СО РАН.

В ходе анализа у каждого пациента были проанализированы 4 аминокислоты, образующиеся в цикле мочевины. Анализ концентрации аминокислот Arg, Cit, Orn и Asp по полной выборке пациентов показал, что колебания их значений соответствуют закону нормального распределения признака со значениями R² > 0,93. Медиана, средние значения, стандартное отклонение нормального распределения, 95% доверительный интервал, разброс (2,5-97,5 процентили) концентрации определяемых аминокислот представлены в Таблице 1.

Таблица 1. Распределение значений концентраций аминокислот.

Сравнение полученных результатов со значениями уровней аминокислот, определённых для других популяций – жителей США [5], Сингапура  [6] и Судана [7] показало, что значительных различий найдено не было только в уровне Cit. Значение 97,5 процентиля для Orn в данной выборке работе было выше в 2 раза по сравнению с другими популяциями, тогда как медиана значительно отличалась только от жителей Судана. Наиболее сильные различия были установлены для Arg и Asp. Значение разброса и медианы Arg в данной выборке значительно ниже, чем в других популяциях, которые между собой отличаются мало. Значение разброса и медианы Asp, наоборот, значительно выше, чем в популяциях жителей США и Судана.

Таблица 2. Сравнение разброса значений аминокислот, участвующих в цикле мочевины.

Заключение

В настоящей работе, на основании анализа обширной выборки пациентов, обобщены и систематизированы данные по уровням концентраций в крови аминокислот Arg, Cit, Orn и Asp, определенных методом ESI-MS/MS. Данные статистически обработаны,  получено распределение концентраций всех аминокислот и определен диапазон нормальных значений. Зафиксировано несколько случаев нарушений метаболизма аминокислот, образующихся в цикле мочевины. Полученные данные позволяют уточнить значения нормы для концентраций Arg, Cit, Orn и Asp при диагностике нарушений цикла мочевины у жителей Западно-Сибирского региона России.

Литература

1. Mew N. A. et al. Urea Cycle Disorders Overview // GeneReviews®[Internet]. URL: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK1217/ (дата обращения: 10.11.2015).
2. Häberle J. et al. Suggested guidelines for the diagnosis and management of urea cycle disorders // Orphanet J. Rare Dis. 2012. Vol. 7, № 1. P. 32.
3. Liebl B., Nennstiel-Ratzel U., von Kries R., Fingerhut R., Olgemoller B., Zapf A., Roscher A.A. // Prev Med. 2002. V. 34.  P. 132–137
4. Chace D.H. // Clinical Chemistry. 2003. V. 49 No. 11.  P. 1797–1817
5. Borum PR. Manual for amino acid analysis of physiological samples. Proceedings of American Association for Clinical Chemistry and Canadian Society of Clinical Chemists 37th National Meeting, Chicago (A-TB-127) 1986:1-12.
6. Tan I.-K., Gajra B. Plasma and urine amino acid profiles in a healthy adult population of Singapore. // Ann. Acad. Med. Singapore. 2006. Т. 35. № 7. С. 468–75.
7. Hassan D.A. et al. Normal Levels of Plasma Amino Acids among Sudanese Adults: The Effect of Gender // J. Med. Sci. 2011. Vol. 11, № 5. P. 246–249.