РАЗНООБРАЗИЕ ПСИХРОТОЛЕРАНТНЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ В АТМОСФЕРНЫХ АЭРОЗОЛЯХ ЗАПАДНОЙ СИБИРИ

Андреева И.С.¹, Соловьянова Н.А.², Вечканов В.А.³, Терновой В.А.⁴

¹канд. биол. наук, доцент, зав. лабораторией, ²научный сотрудник, ³младший научный сотрудник, ⁴канд. биол. наук, зав. лабораторией,

Федеральное бюджетное учреждение науки государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор», р.п. Кольцово Новосибирской области, РФ

РАЗНООБРАЗИЕ ПСИХРОТОЛЕРАНТНЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ В АТМОСФЕРНЫХ АЭРОЗОЛЯХ ЗАПАДНОЙ СИБИРИ

Аннотация

При микробиологическом исследовании высотных и надземных аэрозолей воздуха выделены психрофильные и психротолерантные микроорганизмы, имеющие оптимум роста при температуре 6-10°С с общей концентрацией для разных высот от 3,20×10² до 1,13×10⁵ КОЕ/м³. Cреди выделенных холодолюбивых изолятов в большем количестве и разнообразии, чем среди мезофиллов, были представлены пигментные неспороносные бактерии родов. Рseudomonas, Flavobacterium, Arthrobacter, Micrococcus и пигментные дрожжи родов Sporobolomyces, Criptococcus и ряд других. Высокую численность психротолерантных микроорганизмов наблюдали в образцах аэрозолей, взятых как в холодный, так и в теплый период года. Обнаружены как сапрофитные, так и патогенные и условно-патогенные микроорганизмы. Выявлены дрожжи рода Aureobasidium активно продуцирующие меланины, перспективные для биотехнологических разработок.

Ключевые слова: высотные и надземные аэрозоли атмосферного воздуха, психрофильные и психротолерантные микроорганизмы.

Andreeva I.S.¹, Solovyanova N.A.², Vechkanov V.A.³, Ternovoy V.A.⁴

¹PhD. in Biology, Associate Professor, Head of Laboratory, ²Researcher, ³Junior Researcher, ⁴ PhD. in Biology, Head of Laboratory,

FBUN SRC VB Vector Koltsovo, Novosibirsk region, Russian Federation

THE DIVERSITY OF PSYCHROTOLERANT MICROORGANISMS IN ATMOSPHERIC AEROSOLS OF WESTERN SIBERIA

Abstract

Psychrophilic and psychrotolerant microorganisms with the optimum growth temperature of 6-10°C at the total concentration for different altitudes from 3.20×10² to × 1.13×10⁵ CFU/m³ were isolated in a microbiological study of high-altitude and near-ground atmospheric aerosols. Pigmented nonsporogenous bacteria of the genera Pseudomonas, Flavobacterium, Arthrobacter, Micrococcus and pigmented yeasts of the genera Sporobolomyces, Criptococcus and some others were presented among the isolated psychrophilic isolates in greater quantities and with greater variety than among mesophiles. Large numbers of psychrotolerant microorganisms were found in aerosol samples collected both during the cold and the warm season. Both saprophytic as well as pathogenic and conventionally pathogenic microorganisms were detected. Yeasts of the genus Aureobasidium actively producing melanin and showing promise for biotechnological developments were found.

Keywords: high-altitude and near-ground atmospheric aerosols, psychrophilic and psychrotolerant microorganisms.

Холодолюбивые (психрофильные и психротолерантные) микроорганизмы широко распространены в природе, формируя постоянную микрофлору регионов вечного холода, полярных регионов и океанов, регионов, с пониженными температурами в течение всего года [1]. Приспособление к понижению температуры связывают с изменением состава мембран, со способностью к образованию криопротекторов, повышенным синтезом ключевых ферментов [2]. Психрофилия не является свойством какой-то конкретной систематической группы. Многие психрофилы являются грамотрицательными бактериями, и их представители выявлены среди родов Vibriо, Рseudomonas, Асhrоmоbасtеr, Flavobacterium, Chrоmоbасtеr, Acinetobacter, Cytophaga. Среди грамположительных бактерий психрофилы описаны у видов рода Clostridium, Васillus, Мiсrососсus и др. [3, 4]. Холодостойкие дрожжи известны среди родов Saccharomyces, Zygosaccharomyces, Pichia, Torulopsis, Candida и др. [5, 6]. Несмотря на важность психрофильных организмов в условиях нашей страны, они изучены крайне недостаточно. В настоящей работе представлены данные по численности и разнообразию психротолерантных бактерий и дрожжей, выделенных из образцов атмосферных аэрозолей юга Западной Сибири.

Материалы и методы

Для отбора проб атмосферных аэрозолей использовали импинджеры, содержащие в качестве сорбирующей жидкости 50 мл раствора Хенкса (ICN iomedicals). Высотные пробы аэрозолей отбирали в дневное время с помощью лаборатории «Оптик-Э», смонтированной на базе самолетов АН-30 или ТУ-154, на высотах 7000, 5500, 4000, 2000, 1500, 1000 и 500 м. над Караканским бором (правый берег р. Обь). Наземные пробы воздуха отбирали в импинджеры в течение 30 мин с расходом 50 л/мин на площадках, расположенных на территории ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» и в поселке Ключи Новосибирской области. Отобранные пробы из импинджеров высевали на жидкую и агаризованную питательную среду LB (Difco, США), обедненную среду LB (разбавление 1:10) с добавлением агара до 1,7 %, крахмало-аммиачный (КАА) и почвенный агар (ПА), среду Сабуро. Высевы инкубировали в термостате при температуре 28–30 °С и 6-10ºС, в течение 3–14 суток. Индивидуальные колонии бактерий, выросшие на агаризованных средах, использовали для получения чистых культур и последующего их анализа. Морфологию клеток микроорганизмов исследовали методом фазово-контрастной микроскопии с помощью микроскопа Axioskop 40 (Carl Zeiss, Германия). Изучение физиологических и биохимических свойств изолятов, проведение косвенных тестов на патогенность, устойчивость к антибиотикам выполняли стандартными методами [7, 8].

Генетический анализ бактериальных изолятов проводили с помощью ПЦР со специфическими праймерами (16S рРНК), полученные ДНК фрагменты секвенировали на автоматическом секвенаторе Applied Biosystems 3130xl. Клетки бактериальных изолятов разрушали лизирующим буфером (комплект реагентов для выделения ДНК/РНК, НПФ Литех, Россия) в течении 30 минут и затем выделяли суммарную мРНК согласно прилагаемой к набору инструкции. Построение кДНК проводили с рендом-праймеров, с использованием реактивов, буфера и обратной транскриптазы производства ИнтерЛабСервис (Россия). ПЦР проводили с использованием буфера и полимеразы производства СибЭнзим (Россия) в соответствии с инструкцией по применению. Использовалась следующая программа для проведения ПЦР:

• 94^°C – 10 сек, 60^°C – 20 сек, 72^°C - 30 сек, 40 циклов,
• затем - 72^°C - 7 мин. Продукты ПЦР анализировали в 2.0 % агарозном геле. Определение нуклеотидной последовательности фрагмента генома протеобактерий проводили на автоматическом секвенаторе Applied Biosystems 3130xl (“Hitachi”) с использованием набора ABI prism Big Dye terminator V1 cycle. Для секвенирования использовали продукты амплификации длиной 1360 п.о. Выравнивание производилось с помощью программы «Lasergene 7.1». Филогенетический анализ осуществлялся с помощью программного обеспечения «MEGA4» (методом NJ “Neighbor-Joining”).

Результаты и обсуждение

По результатам фенотипического и геномного анализа микроорганизмов проб атмосферного воздуха были выявлены представители родов Brevibacillus, Kocuria, Brevundimonas, Deinococcus, Micrococcus, Arthrobacter, Flavobacterium, Acetobacter, Bacillus, Paenibacillus, Acinetobacter, Staphylococcus, Streptomyces, Streptococcus, Saccharomyces, Candida, Sporidiobolus, Aureobasidium, Sporobolomyces, Criptococcus и др., основные морфологические типы представлены на рис. 1. При этом общая концентрация микроорганизмов способных расти при 6-10ºС для разных высот составляла от 3,20×10² до 1,13×10⁵ КОЕ/м³.

Рис. 1 - Разнообразие микроорганизмов, выделенное при высеве атмосферных аэрозолей

  Следует отметить, что при всех прочих равных условиях, концентрация психрофильных микроорганизмов в ряде образцов была на 2-3 порядка больше, по сравнению c численностью изолированных мезофильных микроорганизмов. Высокая численность психротолерантных микроорганизмов наблюдалась, как правило, в образцах взятых как в холодный, так и в теплый период года (рис. 2-4).

Рис. 2 - Концентрация психрофильных и мезофильных микроорганизмов (кл./м³) в приземном слое воздуха на территории п. Ключи  в мае и июле 2013 года

 

Рис. 3 - Концентрация психрофильных и мезофильных микроорганизмов (кл./м³) в высотных пробах воздуха над Караканским бором

Рис.4 - Концентрация микроорганизмов (кл./м³) в приземном слое воздуха п. Кольцово с апреля по август 2013 года

Cреди выделенных холодолюбивых изолятов в большем количестве и разнообразии, чем среди мезофиллов, были представлены пигментные неспороносные бактерии и дрожжи. Бактерии, образующие пигменты, обнаружены среди представителей таких родов как Sphingomonas (St-143, St-167, St-168, St-227, St-233 и др.), Staphylococcus (St-177, St-191, St-237 и др.), Nocardiае (St-198, St-199), Methylobacterium (St-207, St-210), Corynebacterium (St-212), Rhodococcus (St-261, St-266), Micrococcus (St-234 и др.), Flavobacterium (St-239, St-242, St-243, St-244 и др.). Изолированы также в значительном количестве пигментированные штаммы дрожжей, формирующих преимущественно розовые колонии с окраской разных оттенков и интенсивности (St-247, St-251 и др.). В значительно большем разнообразии, выделялись дрожжи, имеющие адаптивные признаки, свидетельствующие об их приспособленности к такой среде обитания, как филлосфера: интенсивная пигментация колоний, формирование баллистоспор, сахаролитическая активность в отсутствии гидролитической ферментной системы. Дрожжи с подобными характеристиками могли попасть в атмосферные аэрозоли с частичками пыли, представленными остатками растительного опада [9, 10]. При инкубировании выделенных штаммов дрожжей при температурах от 6-10 и до 42°С выяснено, что ни один из них не растет при температуре 42°С, все исследуемые штаммы имеют умеренный рост при температурах от 20 до 28°С и обильный, интенсивный рост при температуре 6-10°С. В сравнении с мезофильными контрольными культурами дрожжей Saccharomyces cerevisiae и Candida albicans температурный оптимум роста выделенных штаммов был сдвинут в область пониженных температур. Исключением являлся штамм St-450, определенный как Rodotorulla ssp., относящийся к базидиомицетам семейства Cryptococcaceae, активно растущий, как свойственно представителям этого рода, прежде всего патогенным, в широком диапазоне температур - от 6 и до 37°С. Выделенные из аэрозолей штаммы дрожжей отличались формой и размерами клеток, типом почкования (рис.5). Следует отметить, что помимо размножения почкованием штаммы дрожжей, отнесенные к базидиомицетам таких родов как Sporidiobolus, Sporobolomyces, Bullera, были способны образовывать баллистоспоры. О наличии баллистоспор можно было судить по зеркальному отображению на крышке чашки, перевернутой вверх дном, колоний дрожжей, растущих на агаре за счет напыления отбрасываемых спор (А, рис. 6, штамм St-448,). В природе эти дрожжи относятся к «сухопутным», обитают в составе эпифитной микрофлоры и особенно распространены на листовой поверхности культурных и диких злаков [10].

Рис. 5 - Морфология клеток и особенности вегетативного размножения почкованием и делением штаммов дрожжей, выделенных из аэрозолей

Рис. 6 А - зеркальное отображение на крышке чашки Петри штриха штамма дрожжей St-448, образующееся за счет «отстреливания» баллистоспор клетками, растущими в этой же чашке на агаризованной среде; Б – первичные крупные колонии и В - вторичный рост мелких колоний, обусловленный формированием баллистоспор, отбрасываемых первичными колониями

В соответствии с фенотипическим анализом штаммы St-880 и Dr-1, образующие черный, меланоидный пигмент, отнесены к роду Aureobasidium, виду A. pullunans. Микроорганизмы этого рода являются космополитами, чаще всего встречаются на наземных частях растений и во влажных местах обитания. У человека грибы вида A. pullunans  могут быть выделены как загрязняющие покровы человека, их также связывают с отдельными случаями кератита, перитонита, легочной инфекции и инвазийного микоза больных СПИДом [11]. В результате выполненной работы выяснено, что в высотных и наземных аэрозолях атмосферного воздуха психротолерантные микроорганизмы представлены большим разнообразием дрожжей, грамположительных и грамотрицательных бактерий, с численностью в значительной части образцов близкой к количественной характеристике обнаруживаемых мезофильных микроорганизмов или превышающей её. Выделены штаммы дрожжей, продуцирующие каратиноидные и меланиновые пигменты, представляющие интерес для биотехнологии. Показано, что представители родов Aureobasidium, Sporidiobolus, Candida, Rodotorulla и ряда других, среди которых известны патогенные и условно-патогенные штаммы, широко представлены среди психротолерантных дрожжей, выделенных из аэрозолей атмосферного воздуха.

Литература

1. Ленгелер Й. Современная микробиология: прокариоты: в 2 т.; пер. с англ. / Й. Ленгелер, Г. Древс, Г.Шлегель. – М.: Мир, 2005. – 695 с.
2. Ермилова Е.В. Молекулярные аспекты адаптации прокариот / Е.В. Ермилова. - СПб: Изд-во Санкт-Петерб. ун-та, 2007. – C. 172-179 с.
3. RÜGER H.J., FRITZE D. and SPRÖER C.: New psychrophilic and psychrotolerant Bacillus marinus strains from tropical and polar deep-sea sediments and emended description of the species // J. Syst. Evol. Microbiol., 2000.- № 50.- P. 1305-1313.
4. Liu, H.; Xu, Y.; Ma, Y.; Zhou, P. Characterization of Micrococcus antarcticus nov., a psychrophilic bacterium from Antarctica. // Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2000.- № 50.- P. 715–719.
5. Eva Branda1, Benedetta Turchetti1, Guglielmina Diolaiuti2, Massimo Pecci3, Claudio Smiraglia2 & Pietro Buzzin Yeast and yeast-like diversity in the southernmost glacierof Europe (Calderone Glacier,Apennines, Italy) // FEMS Microbiol. Ecol. 2010. - №72.- P. 354–369.
6. Connell LB, Redman R, Craig S, Scorzetti G, Iszard M & Rodriguez R Diversity of soil yeasts isolated from South Victoria Land, Antarctica. // Microb. Ecol. 2008.- № 56.-P. 448–459.
7. Хоулт Дж., Криг Н., Снит П. Определитель бактерий Берджи в 2 тт. - 1997. - 800 с.
8. Методы общей бактериологии: Пер. с англ./Под ред. Ф. Герхардта и др. — М.: Мир, 1984. — 264 с.
9. Кудрявцев В.И. Систематика дрожжей //М.: изд-во АНСССР, 1954. – 427 с.
10. Бабьева И.П., Чернов И.Ю. Биология дрожжей // Москва, 2004.-221 с.
11. Д. Саттон, А.Фотергилл, М. Ринальди Определитель патогенных и условно патогенных грибов // Москва, «Мир», 2001.-С. 468 c.

References

1. Lengeler J. Sovremennaja mikrobiologija: prokarioty: v 2 t.; per. s angl. / J. Lengeler, G. Drevs, G.Shlegel'. – M.: Mir, 2005. – 695 s.
2. Ermilova E.V. Molekuljarnye aspekty adaptacii prokariot / E.V. Ermilova. - SPb: Izd-vo Sankt-Peterb. un-ta, 2007. – C. 172-179 s.
3. RÜGER H.J., FRITZE D. and SPRÖER C.: New psychrophilic and psychrotolerant Bacillus marinus strains from tropical and polar deep-sea sediments and emended description of the species // Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2000.- № 50.- P. 1305-1313.
4. Liu, H.; Xu, Y.; Ma, Y.; Zhou, P. Characterization of Micrococcus antarcticus sp. nov., a psychrophilic bacterium from Antarctica. // Int. J. Syst. Evol. Microbiol., 2000.- № 50.- P. 715–719.
5. Eva Branda1, Benedetta Turchetti1, Guglielmina Diolaiuti2, Massimo Pecci3, Claudio Smiraglia2 & Pietro Buzzin Yeast and yeast-like diversity in the southernmost glacierof Europe (Calderone Glacier,Apennines, Italy) // FEMS Microbiol. Ecol. 2010. - №72.- P. 354–369.
6. Connell LB, Redman R, Craig S, Scorzetti G, Iszard M & Rodriguez R Diversity of soil yeasts isolated from South Victoria Land, Antarctica. // Microb. Ecol. 2008.- № 56.-P. 448–459.
7. Hoult Dzh., Krig N., Snit P. Opredelitel' bakterij Berdzhi v 2 tt. - 1997. - 800 s.
8. Metody obshhej bakteriologii: Per. s angl./Pod red. F. Gerhardta i dr. — M.: Mir, 1984. — 264 s.
9. Kudrjavcev V.I. Sistematika drozhzhej //M.: izd-vo ANSSSR, 1954. – 427 s.
10. Bab'eva I.P., Chernov I.Ju. Biologija drozhzhej // Moskva, 2004.-221 s.
11. D. Satton, A.Fotergill, M. Rinal'di Opredelitel' patogennyh i uslovno patogennyh gribov // Moskva, «Mir», 2001.-S. 468 c.