Использование хроматографических методов при установлении на вещественных доказательствах пятна спермального происхождения и возможности их совершенствования
Использование хроматографических методов при установлении на вещественных доказательствах пятна спермального происхождения и возможности их совершенствования
Аннотация
Объекты биологической природы являются наиболее частыми вещественными доказательствами в судебно-следственных делах по определённым категориям уголовных и гражданских дел. Они являются одной из самых важных приложений судебно-медицинской науки. Из всех выделений человеческого организма наиболее частым объектом внимания судебно-медицинских экспертов является эякулят (сперма). В статье приведены физико-химические методы (биохимический, иммнунохроматографический и тонкослойной хроматографии) для установления спермального происхождения пятна на вещественных доказательствах. Нами предложена усовершенствованная методика тонкоплёночной хроматографиина пластинках Sorbfill ПТСХ-АФ-В-УФ, позволяющий одномоментно четко разделить специфические для спермы компоненты: спермин, холин и кислую фосфатазу. Метод малозатратный, позволяет за короткий период времени провести анализ большого (более 40 объектов), прост в исполнении. Обнаружение трех компонентов в одно пробе размерами пятна 0,3 х 0,3, или ниточке ткани в 1,0-1,5 см, или в вытяжке в 1 мкл свидетельствует о высокой чувствительности метода и является доказательным.
1. Введение
Объекты биологической природы являются самыми распространенными вещественными доказательствами у следствия при судопроизводстве по определённым категориям уголовных и гражданских дел и являются одной из самых важных точек приложения судебно-медицинской науки. Из всех выделений человеческого организма частым объектом судебно-медицинской экспертизы является эякулят. Это объясняется частотой уголовных и гражданских дел, связанных с половыми преступлениями и оплодотворяющей способностью , . Если серологические исследования крови в судебной экспертизе в последнее время становятся приоритетными для молекулярно-генетической экспертизы, то исследование выделений, в частности спермы, на сегодняшний день остались приоритетом судебно-медицинских экспертов – биологов. Это связано с тем, что предварительное исследование на наличие ингредиентов, свойственных эякуляту, имеет свои особенности.
Для доказательства спермального происхождения пятна были предложены множество методов, которые можно разделить на три категории: морфологический, биохимический и элементный. Неоспоримым доказательством до сегодняшнего дня является морфологический – обнаружение целого сперматозоида или его головки, что не всегда возможно. Поэтому предлагаются методы, основанные на обнаружении биохимических компонентов.
Цель исследования: разработать и предложить усовершенствованную методику тонкослойной хроматографии для одномоментного четкого разделения специфических компонентов спермы: спермин, холин и кислую фосфатазу с условиями малозатратности и коротких сроков выполнения.
2. Методы и принципы исследования
Объекты исследования: эякулят лиц (6 человек), обратившихся в специализированную клинику по поводу бесплодных браков и других патологий. Возраст обратившихся 19-65 лет (n=6).
Сперма является сложной тканью по своему составу. В ней содержится почти весь элементный состав таблицы Д.И. Менделеева, аминокислоты, жизненно важные ферменты (кислая фосфатаза, гиалуронидаза, трансаминаза, лактатдегидрогеназа и др.) Некоторые из них наследственно обусловлены, имеют значение для идентификации личности, например кератинфосфаткиназа. Из биохимических компонентов наиболее значимыми для эякулята являются спермин, сложные эфиры холина, андрогены, кислая фосфатаза.
Из ферментов наиболее изучен в судебной медицине кислая фосфатаза,
которая продуцируется простатой и семенными пузырьками и по количественному содержанию превосходит другие выделения (кровь – 3 ед/г; ткань предстательной железы – 500-2500; эякулят – 700-3500 ед/г). Через простату проходят мочеиспускательный канал, два семявыбрасывающих протока. К верхнезадней поверхности предстательной железы прилегают ампулы семявыносящего протока, где скапливаются зрелые сперматозоиды. Сама простата состоит из 30-50 альвеолярных желёз, которые открываются 18-30 выводящими протоками вокруг семенного бугорка. Кроме этого, эпителиальные клетки простаты выделяют в широкий просвет желёз секрет, содержащие липоидные и лецетиновые зёрнышки .
В 50-60-х годах были попытки применить реакцию на кислую фосфатазу как доказательный метод (особенно за рубежом), устанавливая количественное его содержание на различных разделительных основах, индикацией серной кислотой , .
У нас в России впервые разработал количественное определение кислой фосфатазы в сперме А.А. Чарный (1965), проведя более 200 исследований. Но практического применения она у нас не нашла. Был сделан вывод: «обнаружение больших количеств кислой фосфатазы, видимо, позволяет заключить о семенном происхождении пятна, даже при не нахождении сперматозоидов. Однако, следует уточнить, какие именно количества кислой фосфатазы можно считать доказательными». Ввиду отсутствия критериев оценки реакции количественного определения кислой фосфатазы разработка, как доказательная не была утверждена; не установлена нижняя граница определения кислой фосфатазы . Многочисленные исследования кислой фосфатазы для доказательства наличия спермы в пятне позволяют сделать некоторые выводы:
- не обнаружение кислой фосфатазы при отрицательном результате микроскопии позволяет эксперту уверенно говорить о не обнаружении спермы в пятне;
- обнаружение КФ в незначительных количествах позволяет заподозрить семенное происхождение пятна и облегчает выбор участка для другого доказательного метода; или же заподозрить обнаружение её за счет других выделений, например влагалищных;
- положительная реакция на кислую фосфатазу должно подтверждаться доказательными методами: микроскопическим (обнаружение сперматозоида), или иммунохроматографическим (обнаружение ПСА или сперминогелина).
Вопрос специфичности кислой фосфатазы был изучен Н.Н. Ачеркан, Е.Ф. Зарецкая (1979). Авторы установили, что ингибитор кислой фосфатазы – тартрат, при определённых условиях, подавляет активность кислой фосфатазы эритроцитов, всех выделений и жидкостей организма, за исключением спермы. Чувствительность этого метода около 1,27 мкл жидкой спермы. Выделенная простатическая часть кислой фосфатазы считается специфической для пятен спермы. Однако авторы рекомендуют положительный результат подтверждать микроскопическим, или иммунохроматографическим методами .
Надо отметить, что сперматозоиды в пятне присутствуют как в кислой, так и в простатической фракциях эякулята. Кроме того, возможно попадание спермы через семявыносящий и мочеиспускательный каналы, без совершения полового акта .
В последнее время опубликован методический материал по установлению наличия спермы обнаружением простат специфического антигена (ПСА). Наиболее известны иммунохроматографические методы: SERATEC PSA sеmiquvant, Hexagon PSA, PSAchekt. для каждого из них нужен свой буфер и от 100 до 250 мкл вытяжки. В России иммунохроматографичекий метод был апробирован с использованием прибора SERAQUFNT. Метод рассматривается авторами как экспресс-диагностика, сокращающий технологический процесс. Авторы сообщают о вычислении концентрации ПСА, но не сообщают о чувствительности и специфичности. Высокая себестоимость сама по себе ограничивает возможности метода , .
Метод обнаружения спермы твердофазным иммуноферментным анализом с набором реагентов для определения общего ПСА сыворотки крови человека, используется в клинике для диагностики заболеваний предстательной железы . Простота и невысокая затратность являются положительным моментом метода. Однако настораживает обнаружение ПСА в сыворотке крови.
Из биохимических методов иностранными авторами был предложен метод одномоментного обнаружения высокоспецифичных компонентов спермы: эфирных соединений – холина и аминов (в частности спермина) на бумажном носителе, как доказательный , .
Д.Д. Джалалов с соавторами включили третий компонент спермы – кислую фосфатазу и определял скорость её миграции, а также холина и спермина (Rf) на хроматографической бумаге. Данная методика была апробирована в середине прошлого века. Далее она была усовершенствована . Метод ввиду громоздкости и длительности неудобен. Главным недостатком метода является плохое разделение спермина от линии старта.
Проведённый анализ, опубликованных методов установления наличия спермы в пятне, свидетельствует о разносторонних аспектах изучения данного вопроса. Однако до сегодняшнего дня эксперты предпочитают устанавливать спермальный характер пятна морфологическими методами.
В последнее время внимание судебно-медицинских экспертов-химиков привлекает хроматографические методы, особенно объектов наркотического ряда, которые обнаруживаются в биологических объектах, как волосы, сперма, слюна. Мы в своих исследованиях использовали наработки, сделанные в химико-токсикологических лабораториях, и применили их при исследовании пятен спермы.
Исходя из вышеизложенного, целью нашего исследования явились: разработка, на основании анализа имеющихся методов, одномоментный комплексный метод с использованием новых разделительных основ и индикации для доказательства спермального происхождения пятна, с учётом себестоимости.
3. Основные результаты
Были применены новые разделительные основы, позволяющие сократить время анализа, совершенствовать индикацию ингредиентов . Это пластинки Sorbfill ПТСХ-АФ-В-УФ: В качестве растворителя были взяты бутанол – вода – уксусная кислота, в соотношении 2:3:1. Индикация холина реактивом Драгендорфа по Бергоффу-Дельвиче; спермина – реактивом Драгендорфа по Бергоффу-Дельвиче или парами иода; кислой фосфатазы – концентрированной серной кислой. Спермин разгоняется со значением Rf = 0,23-0,27 (табл.1). Одновременно разделяются этим методом холин (Rf= 0,37-0,53), кислая фосфатаза (Rf= 0,94-0,96). Данный метод позволяет, единовременно, за короткий промежуток, провести анализ большого количества объектов, прост в исполнении и не требует больших затрат.
Таблица 1 - Данные значения Rf спермина хроматографией в тонком слое сорбент
Пластики ПТСХ-АФ-В-УФ | Значение Rf c использованием проявителя (n=6) | |
УФ - свет (254 нм) | Пары йода | |
Извлечение из спермы | 0,26±0,02 | 0,25±0,02 |
Стандарт спермина | 0,27±0,02 | 0,23±0,02 |
Таким образом, учитывая, что для хроматографического анализа, требуется пятно размерами не более 0,5 х 0,5 см, или даже несколько ниточек ткани или вытяжка, случайное одновременное попадание в объект исследования трех компонентов исключается.
Методика: на линию старта пластики наносится 10 мкл спиртового извлечения пятна, или ниточка из пятна подозрительного на сперму. Время разгонки до верхнего края разделительной основы, в условиях комнатной температуры. Методика позволяет разделить спермин от других, не специфических для спермы компонентов.
4. Обсуждение
Холин – триметиламинэтанол содержится в организме человека в виде эфирных соединений: ацетилхолина, фосфорхолина, карбаминхолина. В свободном состоянии он не встречается. Через 1-2 часа после эякуляции, под действием кислой фосфатазы спермы, он разлагается и превращается в неорганический фосфор. В сперме человека количество свободного холина превышает 2000 мг%, в крови барана – 22 мг%. Холин продуцируется в семенных пузырьках, содержится в простате, входит в состав лецитина . Имеет длину пробега на бумажном носителе (Rf=0,37), что почти в два раза ниже других эфирных соединений холина в виде пятна желтоватого цвета, в средней части хроматограммы.
Спермин (этиленамин) химическое соединение класса алифатических полиаминов. Вероятно, это тот же γ- семинопротеин (сперминогелин). Это густая жидкость, хорошо кристаллизуется, имеет щелочной характер. Содержание спермина наибольшее в яичках, в 100 г нативной простаты содержится 465 мг спермина. В слюне, влагалищном выделении и кале концентрация спермина столь мала, и методом хроматографии он не обнаруживается.
На применённых бумажных разделительных основах кислая фосфатаза выявляется у линии фронта (Rf = 0,94-0,97), ярко-красного цвета. Холин выявляется в середине хроматограммы. Спермин не отделяется от линии старта.
Проведённый нами анализ научных и практических данных и позволил рекомендовать последовательность проведения экспертизы по половым преступлениям в случаях не обнаружения сперматозоидов.
Исследование любого пятна начинается с визуального осмотра. Пятна спермы имеют характерную визуальную характеристику. Они желтовато-серого цвета, плотноватые на ощупь, («крахмальной жёсткости»), пропитывают ткань насквозь. При не обнаружении сперматозоидов целесообразно провести предварительное, ориентировочное исследование.
В ультрафиолетовых лучах пятна спермы имеют характерное свечение в диапазоне: ультрафиолетовом, инфракрасном синем излучении. Наиболее перспективным по визуализации следа является использование источников экспертного света (ИЭС). Если визуально авторами был получен положительный результат в 46% пятен, то при применении ИЭС – 81% . В свежих пятнах свечения может не быть. Поэтому ориентировочный метод следует провести на кислую фосфатазу, или реакцию с картофельным соком. Эти два метода позволяют быстро исследовать обширные пятна для последующего подробного анализа морфологического и биохимического.
Рисунок 1 - Сперматозоиды млекопитающих:
1 – кролика; 2 – крысы; 3 – морской свинки; 4 – человека
Примечание: В.В. Семёнов, 2018
5. Заключение
При не обнаружении сперматозоидов в пятнах следует применить биохимические методы. Нами предложена усовершенствованная методика тонкослойной хроматографии на пластинках Sorbfill ПТСХ-АФ-В-УФ, позволяющий одномоментно четко разделить специфические для спермы компоненты: спермин, холин и кислую фосфатазу. Метод малозатратный, позволяет за короткий период времени провести анализ большого (более 40 объектов), прост в исполнении. Обнаружение трех компонентов в одно пробе размерами пятна 0,3 х 0,3 см, или ниточке ткани в 1,0-1,5 см, или в вытяжке в 1 мкл свидетельствует о высокой чувствительности метода и является доказательным. В пятне такого размера не могут быть случайными указанные специфические компоненты спермы. Обнаружение даже двух первых компонентов (холина и спермина) доказывает спермальное происхождение пятна.