РАЗРАБОТКА И ПРИМЕНЕНИЕ ИММУНОРЕАГЕНТОВ ДЛЯ СЕРОЭПИЗООТОЛОГИЧЕСКОГО МОНИТОРИНГА ТОКСОКАРОЗА

РАЗРАБОТКА И ПРИМЕНЕНИЕ ИММУНОРЕАГЕНТОВ ДЛЯ СЕРОЭПИЗООТОЛОГИЧЕСКОГО МОНИТОРИНГА ТОКСОКАРОЗА

Научная статья

Новак М.Д.^1, *, Новак А.И.², Канина И.В.³

¹ ORCID: 0000-0002-1421-0039;

² ORCID: 0000-0003-0345-7316;

³ ORCID: 0000-0002-8419-1697;

^{1, 2, 3} Рязанский государственный медицинский университет имени академика И.П. Павлова, Рязань, Россия

* Корреспондирующий автор (peace100[at]mail.ru)

Аннотация

Цель исследований заключалась в разработке параметров получения экскреторно-секреторных антигенов токсокар Toxocara canis (ESAgTox.can) для их последующего использования в иммунодиагностических тестах. Основные задачи работы: получение инвазионного материала от спонтанно зараженных токсокарами собак после дегельминтизации; культивирование инвазионных яиц, извлеченных из матки половозрелых самок гельминтов, а на следующем этапе - личинок с препаративной очисткой и концентрацией продуцируемых ими антигенов; изучение специфичности полученных антигенных препаратов и чувствительности иммунологических тестов; апробация полученных диагностических препаратов на основе ESAgTox.can с использованием сывороток крови от щенков с симптомами токсокароза.

Результаты исследований применяются в ветеринарной практике и потенциально могут быть использованы в разработке экспресс-тестов для диагностики синдрома «larva migrans» Toxocara canis у человека.

Ключевые слова: собаки, токсокароз, токсокары (Toxocara canis), «larva migrans», экскреторно-секреторный антиген (ESAgTox.can), иммунодиагностические тесты.

DEVELOPMENT AND APPLICATION OF IMMUNOREAGENTS FOR SEROEPIZOOTOLOGICAL MONITORING OF TOXOCARIASIS

Research article

Novak M.D.^1, *, Novak A.I.², Kanina I.V.³

¹ ORCID: 0000-0002-1421-0039;

² ORCID: 0000-0003-0345-7316;

³ ORCID: 0000-0002-8419-1697;

^{1, 2, 3} Ryazan State Medical University, Ryazan, Russia

* Corresponding author (peace100[at]mail.ru)

Abstract

The aim of the research was to develop parameters for obtaining excretory-secretory antigens of Toxocara canis (ESAgTox.can) for their subsequent use in immunodiagnostic tests. The main tasks of the study is obtaining infective material from dogs spontaneously infected with toxocara after deworming; cultivation of invasive eggs extracted from the uterus of mature female helminths, and at the next stage cultivation of larvae with preparative purification and concentration of antigens produced by them; examination of the specificity of the antigenic preparations obtained and the sensitivity of immunological tests; testing the diagnostic preparations based on ESAgTox.can using blood serums from pups with symptoms of toxocariasis.

The research results are used in veterinary practice and can potentially be used in the development of rapid tests for the diagnosis of larva migrans Toxocara canis syndrome in humans.

Keywords: dogs, toxocariasis, Toxocara canis, larva migrans, excretory-secretory antigen (ESAgTox.can), immunodiagnostic tests.

Введение

Токсокароз – убиквитарный зооноз, широко распространенный среди плотоядных животных, а также у большого числа видов резервуарных, паратенических хозяев с локализацией личинок Toxocara canis в разных тканях и органах. Синдром «larva migrans» Toxocara canis особенно опасен и может протекать в тяжелой форме не только у собак, диких плотоядных семейства Canidae, но и у человека.

Известны научные работы по изучению природной очаговости, циркуляции возбудителя токсокароза в популяциях дефинитивных хозяев (лисиц, шакалов, песцов), обитающих в лесной и лесостепной зонах, а также исследования по изучению взаимообмена автохтонного и антропургического очагов болезни [9, С. 482], [10, С. 447]. Высокая напряженность эпизоотического процесса обусловлена длительным латентным носительством личинок Toxocara canis, постоянными суперинвазиями и передачей возбудителей токсокароза в цепи «хищник - жертва» от паратенических хозяев (грызунов и др.) восприимчивым видам диких и домашних плотоядных.

Патология, вызываемая мигрирующими личинками токсокар, у плотоядных животных и человека весьма разнообразна и во многом похожа. Гепатопульмоэнтеральная миграция личиночных стадий развития Toxocara canis сопровождается патоморфологическими изменениями в тканях кишечника, печени, легких. Это полиморфно-клеточная пролиферация (плазмоциты, лимфоциты, фибробласты), дистрофические изменения гепатоцитов, клеток альвеолярного и бронхиального эпителия, мезенхимы подслизистого слоя тонкого кишечника. При висцеральной форме токсокароза выражены геморрагический энтерит, гепатит, очаговый некроз и жировая дистрофия печени, бронхопневмония и бронхиальная астма [7]. Отечественные ученые сообщают о повреждающем действии личиночных стадий токсокар и аскарид на ДНК соматических и других клеток организма человека [2, С. 54]. У человека нередко отмечают поражение глаз (глазная форма токсокароза). Наиболее часто случаи заболевания регистрируют среди детей 5-12 лет [1, С. 37].

В зарубежных странах и Российской Федерации разработан ряд иммунологических тестов для выявления антигенов Toxocara canis и антител к ним, циркулирующих в крови человека при синдроме «larva migrans» [3, С. 90], [6, С. 165].

Практическое значение имеет поиск новых препаративных методов получения иммунореагентов для последующего применения их в диагностике токсокароза животных и человека. Наличие достаточного количества тест-систем и экспресс-тестов для диагностики, их высокая чувствительность и специфичность позволят в большом объеме и достоверно проводить сероэпизоотологический и эпидемиологический мониторинг синдрома «larva migrans» при токсокарозе.

При иммунодефицитных состояниях и возможных ложноотрицательных результатах серологического исследования на токсокароз рекомендуется перед проведением скрининга использовать иммуностимуляторы и антиоксидантные препараты [4, С. 48], [5, С. 55], [8].

Методы и принципы исследования

Исследования проведены на кафедрах эпидемиологии и микробиологии ФГБОУ ВО РязГМУ Минздрава России.

При выполнении научной работы использованы гельминтологические копроовоскопические (Фюллеборна, Щербовича), ларвоскопические (Бермана - Орлова), культуральные (по Куликовой) и серологические (реакция непрямой гемагглютинации – РНГА, иммуноферментный анализ – ИФА) методы. Техника выполнения их общепринятая.

Количество яиц и личинок токсокар в культуральной жидкости определяли, используя счетную камеру Мигачевой и Котельникова.

Содержание белковых компонентов в экскреторно-секреторных антигенах личинок токсокар (ESAgTox.can) устанавливали с помощью спектрофотометра УФ 1200. Для РНГА эритроцитарные диагностикумы изготавливали на основе бараньих эритроцитов, сенсибилизированных антигенами по Вайнбаху. Специфичность разработанных антигенных иммунореагентов выясняли в опыте с сыворотками крови поросят, спонтанно инвазированных нематодами Ascaris suum из подотряда Ascaridata, к которому принадлежат Toxocara canis. Биологический цикл их сходен и сопровождается гепатопульмоэнтеральной миграцией личинок.

Инвазионный материал получен от 12 щенков 2,5-4 месячного возраста, спонтанно зараженных токсокарами. После дегельминтизации с применением препарата Пирадек половозрелых самок Toxocara canis доставляли в лабораторию, изолировали матки и путем гомогенизации приготавливали суспензию яиц. Последние культивировали в питательной среде на основе глютамина. Личинки нематод, освободившиеся из яиц через 35-47 дней, после дифференциального центрифугирования подвергали повторному кратковременному (48-72 ч) культивированию. В последующем из культуральной среды, используя методы препаративной биохимии и иммунологии, выделяли экскреторно-секреторные антигены личинок токсокар (ESAgTox.can).

В опытах с помощью гельминтологических и серологических методов исследованы 25 щенков и 50 взрослых собак, а также сыворотки крови от 250 людей.

Основные результаты

Зараженность щенков половозрелыми токсокарами (экстенсивность инвазии - ЭИ) в г. Рязань при исследовании методами копроовоскопии составляет в среднем 13,5 %.

В летний и осенний сезоны уровень инвазии повышается (ЭИ=18-25 %), зимой значительно снижается (ЭИ=4-5,5 %), а в конце весны вновь возрастает (ЭИ=9-12 %). Такая динамика эпизоотического процесса токсокароза обусловлена увеличением весной и летом количества щенков 1,5-4 месяцев и собак 5-6 месячного возраста - латентных носителей половозрелых нематод и основных источников возбудителей инвазии. У животных этого возраста вследствие не завершенного онтогенеза слабо выражена функциональная активность конституционного иммунитета.

Постепенное накопление и персистенция личинок Toxocara canis в тканях собак наряду с их физиологической зрелостью и сформировавшимся иммунным статусом способствует элиминации половозрелых гельминтов из кишечника.

Результаты экспериментальных исследований позволили установить достаточно высокую специфичность и активность экскреторно-секреторных антигенов личинок токсокар (ESAgTox.can). При изучении вышеуказанных параметров в РНГА с использованием гетерологичной иммунной сыворотки против Ascaris suum получены положительные результаты в низких титрах: 1:5-1:10. В соответствии с результатами опыта выбран диагностический титр для РНГА, превышающий пороговые разведения сыворотки в два раза, то есть – 1:20. Аналогичные исследования по изучению эффективности ИФА показали диагностический титр - 1:100, но с более высокими значениями чувствительности. При этом рекомендовано во всех случаях исследований проводить двукратные разведения сывороток крови до 1:2560 в РНГА, 1:10240 - в ИФА.

Экскреторно-секреторные личиночные антигены токсокар (ESAgTox.can) высоко активны с иммунными сыворотками, полученными от щенков с симптомами «larva migrans» Toxocara canis, а также из коммерческой тест-системы Тиаскар (НПО «Вектор», Новосибирск). В опыте с разработанными диагностическими препаратами установлены положительные результаты ИФА, соответствующие указанным разведениям позитивного контроля из набора иммунореагентов Тиаскар.

В последующих исследованиях по продолжительности сохранения активности личиночных антигенов ESAgTox.can при замораживании (от -6 до -18°С) отмечено снижение таковой на 15-20 % через 9-12 месяцев и в два раза – через 18-20 месяцев. Приготовленные эритроцитарные антигенные диагностикумы и сенсибилизированные экскреторно-секреторными антигенами полистироловые планшеты при хранении вне морозильной камеры холодильника (+4-6°С) показывали одинаково высокую чувствительность в РНГА и ИФА на протяжении 12-15 месяцев.

Сравнение результатов скрининга спонтанно зараженных токсокарами щенков при помощи иммунодиагностических тестов (РНГА, ИФА) и методов копроовоскопической диагностики показало корреляцию результатов в 89 % случаев, что объясняется снижением или отсутствием клеточно-гуморального иммунного ответа у животных - носителей только половозрелых токсокар и элиминацией их личиночных стадий. Все-таки достаточно высокий процент совпадения результатов вышеуказанных исследований подтверждает регулярные суперинвазии и миграцию личинок Toxocara canis в тканях щенков. В большинстве таких случаев иммунный ответ на экскреторно-секреторные антигены (ESAgTox.can) сохраняется, но не продолжительный период (до 4-6 месячного возраста), так как затем формируется специфический приобретенный иммунитет. У взрослых собак восприимчивость к токсокарозу выражена, но возбудители до половозрелых форм не развиваются, поэтому результаты сероэпизоотологического мониторинга, особенно важного по беременным животным, не следует сопоставлять с копроовоскопическими.

Разработанные новые иммунореагенты апробированы также при проведении сероэпидемиологических исследований (ИФА) в вузах Рязани. Из 250 сывороток крови от молодых людей 20-22 летнего возраста в иммуноферментном анализе с личиночными антигенами ESAgTox.can положительные результаты получены в 20 % случаев. Клинические признаки, свойственные синдрому «larva migrans» Toxocara canis не выявлены, что подтверждает длительное латентное носительство.

Заключение

Полученные экскреторно-секреторные антигены (ESAgTox) рекомендуется применять в РНГА и ИФА при диагностике синдрома «larva migrans» Toxocara canis у плотоядных животных, а также для скрининга на токсокароз у собак до беременности с целью своевременного проведения дегельминтизации и предотвращения трансплацентарной передачи возбудителя. Потенциально иммунореагенты на основе ESAgTox можно использовать в экспресс-тестах при выполнении сероэпидемиологического мониторинга на токсокароз.

Конфликт интересов Не указан.

Conflict of Interest None declared.

Список литературы / References

1. Бекиш Л.Э. Пораженность детского населения висцеральным токсокарозом в Беларуси / Л.Э. Бекиш // Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями: Материалы докладов научной конференции ВИГИС. – М., 2009. – С. 34-37.
2. Бекиш О.-Я.Л. Повреждения ДНК клеток хозяина при экспериментальном висцеральном токсокарозе / О.-Я.Л. Бекиш, Вл.Я. Бекиш, Л.Э. Бекиш и др. // Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями: Материалы докладов научной конференции ВИГИС. – М., 2005. – С. 52-54.
3. Васильева Е.Г. Иммунологические аспекты токсокароза / Е.Г.Васильева, Ф.М. Соколина // Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями: Материалы докладов научной конференции ВИГИС. – М., 2009. – С. 90-91.
4. Даугалиева Э.Х. Иммунитет при гельминтозах / Э.Х. Даугалиева // Tpуды ВИГИС. – 2000. – Т. 36. – С. 27-49.
5. Енгашев С.В. Клиническое изучение эффективности препарата Эмидонол / С.В. Енгашев, Э.Х. Даугалиева, М.Д. Новак // Ветеринария. – 2014. – № 5. – С. 53-55.
6. Желева Р.Ц. Оценка эффективности реакции непрямой гемагглютинации с антигеном аскарид и токсокар при диагностике симптомокомплекса «larva migrans» у человека / Р.Ц. Желева // Медицинская паразитология и паразитарные болезни. – 1976 – № 2. – С. 160-165.
7. Лысенко А.Я. Токсокароз: учеб. пособие / А.Я. Лысенко, Т.Н.Константинова, Т.И. Авдюхина. – М.: Российская медицинская академия последипломного образования, 2004. – 40 с.
8. Ратникова И. Н. Иммунобиологические показатели при токсокарозе собак и методы его коррекции: автореф. дис. … канд. вет. наук: 03.00.19, 16.00.03 / И.Н. Ратникова; Нижегородская гос. с.-х. акад. – Нижний Новгород, 2002. – 20 с.
9. Усенбаев А.Е. Эпидемическая ситуация по токсокарозу в г. Тараз (Казахстан) / А.Е. Усенбаев, А.М. Кыздарбеков // Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями: Материалы докладов научной конференции ВИГИС. – М., 2008. – С. 482-484.
10. Шишканова Л.В. Распространение и сероэпидемиологические аспекты токсокароза на юге России / Л.В. Шишканова, Т.И. Твердохлебова, Ю.И. Васерин и др. // Теория и практика борьбы с паразитарными болезнями: Материалы докладов научной конференции ВИГИС. – М., 2009. – С. 445-448.

Список литературы на английском языке / References in English

1. Bekish L.E. Porazhennost' detskogo naselenija visceral'nym toksokarozom v Belarusi [Infestation of the child population with visceral Toxocarosis in Belarus] / L.E. Bekish // Teorija i praktika bor'by s parazitarnymi boleznjami: Materialy dokladov nauchnoj konferencii VIGIS [Theory and practice of combating parasitic diseases: Materials of the reports of the scientific conference VIGIS]. – M., 2009. – Р. 34-37. [in Russian]
2. Bekish O.-Ya.L. Povrezhdenija DNK kletok hozjaina pri jeksperimental'nom visceral'nom toksokaroze [DNA damage of host cells in experimental visceral Toxocarosis] / O.-Ya.L. Bekish, V.Ya. Bekish, L.E. Bekish et al. // Teorija i praktika bor'by s parazitarnymi boleznjami: Materialy dokladov nauchnoj konferencii VIGIS [Theory and practice of combating parasitic diseases: Materials of the reports of the scientific conference VIGIS]. – M., 2005. – Р. 52-54. [in Russian]
3. Vasilyeva E.G. Immunologicheskie aspekty toksokaroza [Immunological aspects of Toxocarosis] / E.G. Vasilyeva, F.M. Sokolina // Teorija i praktika bor'by s parazitarnymi boleznjami: Materialy dokladov nauchnoj konferencii VIGIS [Theory and practice of combating parasitic diseases: Materials of the reports of the scientific conference VIGIS]. – M., 2009. – Р. 90-91. [in Russian]
4. Daugalieva E.H. Immunitet pri gel'mintozah [Immunity in helminthiasis] / E. H. Daugalieva // Tpudy VIGIS [Proceedings of VIGIS]. – 2000. – Vol. 36. – Р. 27-49. [in Russian]
5. Engashev S.V. Klinicheskoe izuchenie jeffektivnosti preparata Jemidonol [Clinical study of the effectiveness of the drug Emidonol] / S.V. Engashev, E.H. Daugalieva, M.D. Novak // Veterinarija [Veterinary medicine]. – 2014. – No. 5. – Р. 53-55. [in Russian]
6. Zheleva R.C. Ocenka jeffektivnosti reakcii neprjamoj gemaggljutinacii s antigenom askarid i toksokar pri diagnostike simptomokompleksa «larva migrans» u cheloveka [Evaluation of the effectiveness of the reaction of indirect hemagglutination with the ascarid and toxocar antigen in the diagnosis of the larva migrans symptom complex in humans] / R.C. Zheleva // Medicinskaja parazitologija i parazitarnye bolezni [Medical parasitology and parasitic diseases]. – 1976 – No. 2. – Р. 160-165. [in Russian]
7. Lysenko, A. Ya. Toksokaroz [Toxocarosis]: studies. manual / A.Ya. Lysenko, T.N. Konstantinova, T.I. Avdyukhina. - M.: Russian Medical Academy of Postgraduate Education, 2004. – 40 p. [in Russian]
8. Ratnikova I.N. Immunobiologicheskie pokazateli pri toksokaroze sobak i metody ego korrekcii [Immunobiological indicators in dogs with Toxocarosis and methods of its correction]: abstract. dis. ... Candidate of Vet. sciences: 03.00.19, 16.00.03 / I.N. Ratnikova; Nizhegorod state S.-H. akad. - Nizhny Novgorod, 2002. – 20 p. [in Russian]
9. Usenbayev A.E. Jepidemicheskaja situacija po toksokarozu v g. Taraz (Kazahstan) [The epidemic situation of Toxocarosis in Taraz (Kazakhstan)] / A.E. Usenbayev, A.M. Kyzdarbekov // Teorija i praktika bor'by s parazitarnymi boleznjami: Materialy dokladov nauchnoj konferencii VIGIS [Theory and practice of combating parasitic diseases: Materials of reports of the scientific conference VIGIS]. – M., 2008. – Р. 482-484. [in Russian]
10. Shishkanova L.V. Rasprostranenie i serojepidemiologicheskie aspekty toksokaroza na juge Rossii [Distribution and seroepidemiological aspects of Toxocarosis in the south of Russia] / L.V. Shishkanova, T.I. Tverdokhlebova, Yu.I. Vaserin et al. // Teorija i praktika bor'by s parazitarnymi boleznjami: Materialy dokladov nauchnoj konferencii VIGIS [Theory and practice of combating parasitic diseases: Materials of the reports of the scientific conference VIGIS]. – M., 2009. – Р. 445-448. [in Russian]