БИОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА И РЕЗИСТЕНТНОСТЬ К ДЕЗИНФЕКТАНТАМ ПСЕВДОМОНАД, ВЫДЕЛЕННЫХ ОТ ПАЦИЕНТОВ ОЖОГОВОГО СТАЦИОНАРА

БИОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА И РЕЗИСТЕНТНОСТЬ К ДЕЗИНФЕКТАНТАМ ПСЕВДОМОНАД, ВЫДЕЛЕННЫХ ОТ ПАЦИЕНТОВ ОЖОГОВОГО СТАЦИОНАРА

Научная статья

Мартусевич А.К.^1, *, Абрамова Н.В.², Бочарин И.В.³, Maлышева К.С.⁴, Рычагова Е.М.⁵

¹ ORCID: 0000-0002-0818-5316;

³ ORCID: 0000-0002-4961-5351;

¹ Нижегородский государственный университет им. Н.И. Лобачевского, Нижний Новгород, Россия;

¹ Нижегородская государственная сельскохозяйственная академия, Нижний Новгород, Россия;

^{1, 2, 3, 4, 5} Приволжский исследовательский медицинский университет, Нижний Новгород, Россия

* Корреспондирующий автор (cryst-mart[at]yandex.ru)

Аннотация

Целью данного исследования служило изучение биологических свойств псевдомонад, выделенных от пациентов ожогового стационара, и их резистентности к дезинфектанту. Использовали 8 штаммов P. aeruginosa. Для идентификации штаммов бактерий использовались окраска по Граму, анализ подвижности, культуральные и биохимические признаки, в том числе – оксидазный. На основании изучения ключевых дифференциальных признаков установлено, что штаммы бактерий, выделенных от обожженных пациентов, относились к виду P. aeruginosa. Раскрыты биологические свойства выделенных штаммов микроорганизмов, продемонстрирована их гетерогенность. Показано, что штаммы псевдомонад обладают неодинаковой резистентностью к дезинфектанту.

Ключевые слова: псевдомонады, ожоговый стационар, дезинфектанты.

ON THE BIOLOGICAL CHARACTERISTICS AND RESISTANCE TO DISINFECTANTS OF PSEUDOMONADS ISOLATED FROM BURN CARE FACILITY PATIENTS

Research article

Martusevich A.K.^1, *, Abramova N.V.², Bocharin I.V.³, Malisheva K.S.⁴, Richagova Y.M.⁵

¹ ORCID: 0000-0002-0818-5316;

³ ORCID: 0000-0002-4961-5351;

¹ Nizhny Novgorod State University named after N.I. Lobachevsky, Nizhny Novgorod, Russia;

¹ Nizhny Novgorod State Agricultural Academy, Nizhny Novgorod, Russia;

^{1, 2, 3, 4, 5} Privolzhsky Research Medical University, Nizhny Novgorod, Russia

* Corresponding author (cryst-mart[at]yandex.ru)

Abstract

The purpose of this study was to examine the biological properties of pseudomonads isolated from burn hospital patients and their resistance to a disinfectant. The study used 8 strains of P. aeruginosa. To identify bacterial strains, the authors used Gram staining, motility analysis, cultural and biochemical signs, including oxidase. Based on the study of key differential signs, it was found that the bacterial strains isolated from burned patients belonged to the species P. aeruginosa. The study determines the biological properties of the isolated strains of microorganisms and demonstrated their heterogeneity. Also, the study showed that pseudomonas strains have unequal resistance to a disinfectant.

Keywords: pseudomonads, burn care facility, disinfectants.

Введение

С 70-х годов ХХ века синегнойная палочка (Pseudomonas aeruginosa) является одним из основных возбудителей локальных и системных гнойно-воспалительных процессов, возникающих в стационарах. Подобные заболевания принято обозначать как внутрибольничную инфекцию (ВБИ) - любое клинически выраженное заболевание микробного происхождения, поражающее больного в результате его госпитализации или посещения лечебного учреждения с целью лечения, а также больничный персонал в силу осуществляемой им деятельности, независимо от того, проявляются ли симптомы этого заболевания во время нахождения данных лиц в больнице. В настоящее время проблема ВБИ остается самой актуальной в системе здравоохранения [1].

Наибольшее количество исследований, касающихся изучения синегнойной инфекции, выполнено на материале ожоговых отделений, хирургических стационаров и онкологических центров [2]. Ожоговая рана в большей степени подвержена инфекции, чем при других видах травм. Кроме того, высока частота генерализации инфекции, а сепсис раннего периода ожоговой болезни, наиболее часто вызываемый синегнойной палочкой, характеризуется молниеносным развитием, тяжелым течением и крайне высокой летальностью.

Устойчивость синегнойной палочки во внешней среде, наличие мощных факторов вирулентности, а также естественная резистентность к антибактериальным препаратам определяют широту ее распространения и формирования госпитальных штаммов, что превращает ожоговый стационар в «эпидемиологический очаг» синегнойной инфекции [3]. Все вышеперечисленное определяет обоснованность интереса специалистов к проводимым в комбустиологических стационарах мероприятиям по дезинфекции. На этом основании целью данного исследования служило изучение биологических свойств псевдомонад, выделенных от пациентов ожогового стационара, и их резистентности к дезинфектанту.

Методы и принципы исследования

Использовали 8 штаммов P. aeruginosa, выделенных от пациентов ожогового центра Университетской клиники ФГБОУ ВО «ПИМУ» Минздрава России. Для идентификации штаммов бактерий использовались ключевые признаки: окраска по Граму, анализ подвижности, культуральные и биохимические признаки, в том числе - оксидазный [4]. Оксидазный тест позволял дифференцировать Гр(-) энтеробактерии и Гр(-) псевдомонады [4], [5], [6]. Тест проводился с помощью коммерческих диагностических полосок ОКСИтест фирмы «ПЛИВА-Лахема» (Чехия). Для проведения анализа отделяли хорошо изолированную колонию (или бактериальную массу в случае чистой культуры) тестируемого штамма на агаровой питательной среде и микробиологической петлей втирали ее в зону индикации полоски. Цветную реакцию учитывали в течение 0,5-1 мин, т.к. при более длительно экспозиции могли возникнуть ложноположительные реакции.

Проведено определение биохимической активности P. aeruginosa [6], [7], [8], [9]. Анализ биохимической активности P. aeruginosa проводили с использованием коммерческих микротест-систем НЕФЕРМтест 24 фирмы «ПЛИВА-Лахема» (Чехия). Система представляет собой планшет с четырьмя трехрядными вертикальными стрипами с субстратами для 24 тестов: индол, аргинин, уреаза, лизин, глюкоза, фруктоза, инозитол, сахароза, фосфотаза, β-галактозидаза, β-глюкозидаза, N-ацетил-β-D-глюкозамидаза, маннитол, ксилоза, целлобиоза, галактоза, нитраты, нитриты, эскулин, γ-глютаминтрансфераза, лактоза, мальтоза, трегалоза, цитрат Симмонса.

Для проведения анализа выделяли чистую культуру на кровяном агаре [10]. Из чистой 24-часовой культуры готовили суспензию в физиологическом растворе, соответствующую по плотности 0,5 по стандарту McFarland и содержащую примерно 1,5 х 10⁸ КОЕ/мл. Инокулировали приготовленную суспензию бактерий по 0,1 мл в лунки Н-Е всех трех рядов стрипа (12 лунок). Добавляли 1 мл этой же суспензии в ампулу с суспензионной средой для НЕФЕРМтест 24, тщательно гомогенизировали разбавленную суспензию и инокулировали ее в остальные 12 лунок D-A стрипа. После инокуляции в лунки Н, G, F и Е первого ряда стрипа (тесты индол, аргинин, уреаза, лизин) добавляли по 2 капли парафинового масла. Инкубировали инокулированную пластинку в течение 48 часов при температуре 30ºС.

По окончании инкубации добавляли соответствующие реактивы. Инкубировали пластинку 10-15 минут при комнатной температуре для хорошего проявления цветных реакций [8], [10]. Учет результатов проводился на автоматическом микробиологическом анализаторе. С целью определения активности протеолитических ферментов оценивали разжижение желатина.

Для оценки резистентности штаммов псеводомонад к дезинфектанту проводили специальный тест. Тестируемым антисептиком являлся «Десам» в форме стандартного 1% раствора, применяемого для дезинфекции поверхностей и медицинского инструментария.

Основные результаты

На первом этапе явилось изучение ключевых дифференциально значимых признаков штаммов, выделенных от пациентов с термическими травмами, и определение их видовой принадлежности. В соответствии с данными, представленными в таблице 1, биохимические признаки исследуемых штаммов практически полностью соответствуют таковым эталонного штамма P. aeruginosa.

 

Таблица 1 – Ключевые бактериологические признаки штаммов P. aeruginosa

Признак	Эталонный штамм P.aeruginosa	Исследованные штаммы P. aeruginosa
		904	1268	88	84	133	137	82	649
Гр- палочки	+	+	+	+	+	+	+	+	+
оксидаза	+	+	+	+	+	+	+	+	+
подвижность	+	+	+	+	+	+	+	+	+
фосфатаза	–	–	–	–	–	–	–	–	–
уреаза	+	+	+	+	+	+	+	+	+
β-галактозидаза	–	–	–	–	–	–	–	–	–
β-глюкозидаза	–	–	–	–	–	–	–	–	–
галактозидаза	+	+	+	+	+	+	+	+	+
γ-глютамин-трансфераза	+	+	+	+	+	+	+	+	+
аргинин	+	+	+	+	+	+	+	+	+
лизин	–	–	–	–	–	–	–	–	–
глюкоза	+	–	–	+	+	+	+	–	+
фруктоза	+	+	–	–	–	+	+	+	+
сахароза	–	–	–	–	–	–	–	–	–
манноза	–	–	–	–	–	–	–	–	–
ксилоза	+	+	+	+	+	+	+	+	+
целлобиоза	–	–	–	–	–	–	–	–	–
лактоза	–	–	–	–	–	–	–	–	–
мальтоза	–	–	–	–	–	–	–	–	–
трегалоза	–	–	+	–	–	–	–	–	–
инозит	–	–	–	–	–	–	–	–	–
NO3	+	–	–	+	+	–	–	+	–
NO2	+	+	+	–	–	+	+	+	+
эскулин	–	–	–	–	–	–	–	–	–
цитрат	+	+	+	+	+	+	+	+	+
NaCl	–	–	–	–	–	–	–	–	–
индол	–	–	–	–	–	–	–	–	–
желатин	+	+	+	+	+	+	+	+	+

 

Морфологические признаки (анализируемые бактерии - грамотрицательные оксидазоположительные тонкие палочки) в комплексе с биохимическими подтверждают принадлежность исследуемых штаммов к роду Pseudomonas, виду P. aeruginosa. На следующем этапе работы проводилась оценка эффекта действия антисептика «Десам» на исследуемые штаммы P. aeruginosa. Для исследования использовался 1% раствор изучаемого дезинфицирующего средства. Результаты исследования представлены в таблице 2. На основании проведенных предварительных микробиологических исследований на чувствительность выделенных штаммов, проводимых с использованием в качестве «золотого стандарта» метода «квадратов», установлено (табл. 2), что соотношение чувствительных и резистентных штаммов обнаружено как 5 : 3.

 

Таблица 2 – Оценка эффекта действия препарата «Десам» на рост исследуемых штаммов P. aeruginosa

Наименование антисептика	Активно-действующее вещество	Зона подавления роста, мм
		Исследованные штаммы P. aeruginosa
		904	1268	133	137	84	88	82	649
Десам 1%	H2O2, ЧАС, альдегид	18	18	-	-	20	17	17	-

Примечание: «-» - отсутствие зоны задержки роста  

В числе чувствительных штаммов – №904, 1268, 84, 88, 82, к резистентным отнесены штаммы №133, 137, 649. Доля чувствительных и резистентных к 1% раствору средства «Десам» штаммов наглядно отображена в таблице 2. Следует отметить, что большинство проанализированных штаммов оказались чувствительными к примененной рабочей концентрации тестируемого дезинфектанта, что нужно рассматривать как позитивный момент.

Заключение

На основании изучения ключевых дифференциально значимых признаков установлено, что штаммы бактерий, выделенных от пациентов с термическими травмами, относились к виду P. aeruginosa. Показано, что штаммы псевдомонад обладают неодинаковой резистентностью к дезинфектанту – препарату «Десам».

Конфликт интересов Не указан.

Conflict of Interest None declared.

Список литературы / References

1. Меньшиков В.В. Клиническая лабораторная аналитика. Частные аналитические технологии в клинической лаборатории: в 4 т.; / В.В. Меньшиков – М.: АГАТ-МЕД, 2003. – IV т.
2. Красникова Л.В. Микробиологическая безопасность пищевого сырья и готовой продукции / Л.В. Красникова, П.И. Гунькова – СПб: НИУ ИТМО; ИХиБТ, 2014. – 91 c.
3. Скала Л.З. Практические аспекты современной клинической микробиологии / Л.З. Скала, С.В. Сидоренко, А.Г. Нехорошева – Тверь: Триада, 2004. – 312 c.
4. Городницкая Н.И. Биологические свойства Pseudomonas aeruginosa при культивировании на различных искусственных питательных средах. / Н.И. Городницкая, А.В. Мартынов, Т.П. Осолодченко // Вестник Харьковского национального университета имени В.Н. Каразина. Серия «Медицина».. – 2007. – 7. – c. 5-10.
5. Викторов Д.А. Выделение и изучение биологических свойств бактериофагов Pseudomonas chlororaphis. / Д.А. Викторов, Т.А. Гринева, Д.А. Васильев // Вестник Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии. – 2014. – 3. – c. 45-49.
6. Васильев Д.А. Выделение и типирование бактерии Pseudomonas putida. / Д.А. Васильев, Д.А. Викторов, И.И. Богданов и др. // Вестник Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии. – 2009. – 3. – c. 58-60.
7. Зубков М.Н. Неферментирующие бактерии: классификация, общая характеристика, роль в патологии человека. Идентификация Pseudomonas spp. и сходных микроорганизмов. / М.Н. Зубков // Инфекции и антимикробная терапия. – 2003. – 1. – c. 24-30.
8. Шагинян И.А. Неферментирующие грамотрицательные бактерии в этиологии внутрибольничных инфекций: клинические, микробиологические и эпидемиологические особенности. / И.А. Шагинян, М.Ю. Чернуха // Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. – 2005. – 3. – c. 271-285..
9. Бороздина И.Б. Сравнительное изучение питательных сред для выделения Ps. Аeruginosa с поверхности филлоплана. / И.Б. Бороздина // Вестник Алтайского государственного аграрного университета. – 2011. – 4. – c. 43-48.
10. Кувакина, Н.А. Влияние озонированного физиологического раствора на вирулентность синегнойных бактерий / Н.А. Кувакина. Автореф. дисс. канд. мед. наук. Москва, 2006. 21 с.

Список литературы на английском языке / References in English

1. Men'shikov V.V. Klinicheskaya laboratornaya analitika. Chastny'e analiticheskie texnologii v klinicheskoj laboratorii [Clinical laboratory analysis. Private analytical technologies in the clinical laboratory]: in 4 vol.; / V.V. Men'shikov – M.: AGAT-MED, 2003. – IV vol. [in Russian]
2. Krasnikova L.V. Mikrobiologicheskaya bezopasnost' pishhevogo sy'r'ya i gotovoj produkcii [Microbiological safety of food raw materials and finished products] / L.V. Krasnikova, P.I. Gun'kova – SPb: NIU ITMO; IXiBT, 2014. – 91 p. [in Russian]
3. Skala L.Z. Prakticheskie aspekty' sovremennoj klinicheskoj mikrobiologii [Practical aspects of modern clinical microbiology] / L.Z. Skala, S.V. Sidorenko, A.G. Nexorosheva – Tver': Triada, 2004. – 312 p. [in Russian]
4. Gorodniczkaya N.I. Biologicheskie svojstva Pseudomonas aeruginosa pri kul'tivirovanii na razlichny'x iskusstvenny'x pitatel'ny'x sredax [Biological properties of Pseudomonas aeruginosa when cultivated on various artificial nutrient media]. / N.I. Gorodniczkaya, A.V. Marty'nov, T.P. Osolodchenko // Vestnik Xar'kovskogo nacional'nogo universiteta imeni N. Karazina. Seriya «Medicina». [Bulletin of V.N. Karazin Kharkiv National University. The series "Medicine".]. – 2007. – 7. – p. 5-10. [in Russian]
5. Viktorov D.A. Vy'delenie i izuchenie biologicheskix svojstv bakteriofagov Pseudomonas chlororaphis [Isolation and study of biological properties of Pseudomonas chlororaphis bacteriophages]. / D.A. Viktorov, T.A. Grineva, D.A. Vasil'ev // Vestnik Ul'yanovskoj gosudarstvennoj sel'skoxozyajstvennoj akademii [Bulletin of the Ulyanovsk State Agricultural Academy]. – 2014. – 3. – p. 45-49. [in Russian]
6. Vasil'ev D.A. Vy'delenie i tipirovanie bakterii Pseudomonas putida [Isolation and typing of Pseudomonas putida bacteria]. / D.A. Vasil'ev, D.A. Viktorov, I.I. Bogdanov et al. // Vestnik Ul'yanovskoj gosudarstvennoj sel'skoxozyajstvennoj akademii [Bulletin of the Ulyanovsk State Agricultural Academy]. – 2009. – 3. – p. 58-60. [in Russian]
7. Zubkov M.N. Nefermentiruyushhie bakterii: klassifikaciya, obshhaya xarakteristika, rol' v patologii cheloveka. Identifikaciya Pseudomonas spp. i sxodny'x mikroorganizmov [Non-fermenting bacteria: classification, general characteristics, role in human pathology. Identification of Pseudomonas spp. and similar microorganisms]. / M.N. Zubkov // Infekcii i antimikrobnaya terapiya [Infections and antimicrobial therapy]. – 2003. – 1. – p. 24-30. [in Russian]
8. Shaginyan I.A. Nefermentiruyushhie gramotriczatel'ny'e bakterii v e'tiologii vnutribol'nichny'x infekcij: klinicheskie, mikrobiologicheskie i e'pidemiologicheskie osobennosti [Non-fermenting gram-negative bacteria in the etiology of nosocomial infections: clinical, microbiological and epidemiological features]. / I.A. Shaginyan, M.Yu. Chernuxa // Klinicheskaya mikrobiologiya i antimikrobnaya ximioterapiya [Clinical microbiology and antimicrobial chemotherapy]. – 2005. – 3. – 271-285. [in Russian]
9. Borozdina I.B. Sravnitel'noe izuchenie pitatel'ny'x sred dlya vy'deleniya Ps. Aeruginosa s poverxnosti filloplana [Comparative study of nutrient media for Ps isolation. Aegidiposa from the surface of the phylloplane]. / I.B. Borozdina // Vestnik Altajskogo gosudarstvennogo agrarnogo universiteta [Bulletin of the Altai State Agrarian University]. – 2011. – 4. – 43-48. [in Russian]
10. Kuvakina, N.A. Vlijanie ozonirovannogo fiziologicheskogo rastvora na virulentnost' sinegnojnyh bakterij [The effect of ozonated saline solution on the virulence of Pseudomonas bacteria] / N.A. Kuvakina, Autoref. diss. candidate of medical sciences. Moscow, 2006. 21 p. [in Russian]