ПРИМЕНЕНИЕ ТЕСТА НА АНТИМИКРОБНЫЙ ПЕПТИД ЛАКТОФЕРРИЦИН ПРИ АППЕНДИЦИТЕ И ПЕРИТОНИТЕ
ПРИМЕНЕНИЕ ТЕСТА НА АНТИМИКРОБНЫЙ ПЕПТИД ЛАКТОФЕРРИЦИН ПРИ АППЕНДИЦИТЕ И ПЕРИТОНИТЕ
Аннотация
Перитонит был и остается важнейшим фактором в структуре летальности хирургических пациентов с бактериальной абдоминальной инфекцией. К числу значимых для хирургии антибактериальных компонентов иммунной системы относится железосодержащий белок лактоферрин (ЛФ) и его положительно заряженный фрагмент – лактоферрицин (ЛФЦ). Цель исследования: применение тест-системы для иммуноферментного анализа ЛФ и ЛФЦ в сыворотках крови и перитонеальном экссудате у больных с острым деструктивным аппендицитом. Материалы и методы. В образцах сывороток крови и перитонеальном экссудате 45 больных с деструктивными формами аппендицита различной степени тяжести после лапароскопической или лапаротомной аппендэктомии исследовали концентрации белка ЛФ и пептида ЛФЦ. Результаты исследования. При изучении уровней ЛФ и ЛФЦ у больных с острым деструктивным аппендицитом установлено, что их уровни отличаются от цифр у доноров в 3 раза и по ЛФ, и по ЛФЦ. Установлено, что концентрации ЛФ в перитонеальном экссудате всегда статистически достоверно (p<0,05) превышали сывороточные уровни ЛФ во всех группах пациентов с аппендицитом примерно в 3-4 раза, а цифры ЛФЦ в перитонеальном экссудате статистически достоверно от сывороточных уровней этих же больных не отличались. Заключение. В данной работе нами показано, что при остром осложненном аппендиците, в том числе, осложненном перитонитом, наблюдаются статистически достоверное повышенные концентрации белка лактоферрина и пептида лактоферрицина относительно нормы и в сыворотке крови, и в перитонеальном экссудате. Обнаруженные различия в эффектах лактоферрина и лактоферрицина при остром деструктивном аппендиците определяются различными механизмами антибактериального действия белка лактоферрина и пептида лактоферрицина. Более высокие цифры ЛФ в перитонеальном экссудате при деструктивном аппендиците, по сравнению с сывороточными концентрациями ЛФ, отражают роль железа в механизме бактерицидной и бактериостатической активности молекулы ЛФ в процессе транслокации эндогенного белка из кишечника в брюшную полость. У пептида ЛФЦ, не имеющего отношения к метаболизму железа, антимикробная активность связана со специфической структурой и аминокислотным составом ЛФЦ, проявляющейся в одинаковой степени и в крови, и в перитонеальном экссудате.
1. Введение
Перитонит был и остается важнейшим фактором в структуре летальности хирургических пациентов с бактериальной абдоминальной инфекцией , . К причинам, обеспечивающим неудовлетворительный прогноз течения интраабдоминальной инфекции при перитоните, относятся генерализованные реакции макроорганизма больного, связанные с бактериальными эндо- и экзотоксинами и эффектами различных медиаторов воспаления , . В хирургической практике при назначении рациональной антибактериальной терапии приходится ориентироваться не только на бактериологическое исследование или современные высокотехнологичные хроматографические способы оценки микробного состава возбудителя бактериальной инфекции, но и оценивать параметры других лабораторных тестов и специфических биомаркеров, отражающих состояние нарушенного гомеостаза в различных средах организма больного , , .
В число значимых для хирургии антибактериальных компонентов иммунной системы относится железосодержащий белок лактоферрин (ЛФ) , , и его положительно заряженный фрагмент – лактоферрицин (ЛФЦ) , , . Не обладая способностью связывать железо, ЛФЦ, тем не менее, за счет характерного распределения положительного заряда по поверхности пептида способен специфически связывать бактериальный липополисахарид , . Обнаружено, что антимикробная способность ЛФЦ во много раз выше, антимикробной активности ЛФ, и распространяется, в том числе на штаммы инфекций, резистентных к антибиотикам , .
В ранних работах для экспериментов и клинических испытаний мы использовали сложную многоступенчатую процедуру выделения ЛФЦ из индивидуальных образцов сывороток крови и перитонеального экссудате, включавшую кислотный гидролиз образцов пепсином в термостате в течение 4 часов при 37°С, последующую депротеинизацию образцов трихлоруксусной кислотой, отделение осадка центрифугированием, нейтрализацию фильтрате и определение концентрации лактоферрицина в пробах на спектрофотометре при длине волны 280 нм. Результаты измерения выражали в единицах оптической плотности на мл , . В данной работе концентрацию ЛФЦ определяли с помощью, разработанного авторами способа получения моноспецифических кроличьих антител к пептиду лактоферрицину человека (патент РФ № 2795322) .
Цель исследования – оценка перспектив применения тест-системы для иммуноферментного анализа лактоферрицина для оценки уровней лактоферрина (ЛФ) и лактоферрицина (ЛФЦ) в сыворотках крови и перитонеальном экссудате у больных с острым осложненным аппендицитом.
2. Методы и принципы исследования
Больные с деструктивными формами острого аппендицита проходили хирургическое лечение в ГБУЗ АО «Александро-Мариинская областная клиническая больница» г. Астрахани в период 2021-2023 годов. В соответствии с целью настоящей работы обследовано 44 пациентов обоего пола (21 мужчина и 24 женщины) в возрасте от 21 до 55 лет. Средний возраст обследованных пациентов основной группы составил 35,9±1,3 лет (36,2±2,1 лет среди мужчин и 35,6±1,6 лет среди женщин). Из исследования исключены пациенты с неосложненным (катаральным) острым аппендицитом, беременные женщины, пациенты с хроническими заболеваниями, изменяющими иммунный статус (туберкулез, ЗППП, ВИЧ-инфекции). По степени тяжести деструктивный аппендицит пациенты основной группы были распределены на три подгруппы: 20 больных с флегмонозным аппендицитом (по 10 мужчина и женщины), 14 больных с гангренозным аппендицитом (6 мужчина и 8 женщины), и 10 больных с распространенным аппендикулярным перитонитом (5 мужчина и 5 женщины). Средний возраст обследованных пациентов в подгруппе с флегмонозным аппендицитом составил 34,1±1,6 лет (33,9±2,5 лет среди мужчин и 34,2±2,3 лет среди женщин), в подгруппе с гангренозным аппендицитом составил 36,3±2,3 лет (37,3±3,8 лет среди мужчин и 35,5±3,1 лет среди женщин) и в подгруппе с аппендикулярным перитонитом составил 38,9±3,4 лет (39,4±5,4 лет среди мужчин и 38,4±4,8 лет среди женщин). По половому признаку достоверных различий между группами мужчин и женщин ни в одной из трех подгрупп опытной группы не установлено. В контрольную группу вошли 40 доноров крови (по 20 доноров каждого пола) в возрасте от 20 до 53 лет (средний возраст 32,9±1,7 года среди мужчин и 32,0±1,7 года среди женщин).
Всем 44 отобранным пациентам для установления диагноза «деструктивный аппендицит или аппендикулярный перитонит» при поступлении проводился общепринятый клинический осмотр с оценкой общего и локального статуса, выполнялись необходимые лабораторные и инструментальные методы обследования: общий анализ крови, мочи, УЗИ органов брюшной полости, обзорная рентгенография брюшной полости, грудной клетки, и стандартные биохимические анализы крови. Обследованным пациентам после кратковременной предоперационной подготовки быть выполнена или лапароскопическая (ЛСА) или открытая лапаротомная аппендэктомия (ЛТА). Лапароскопическую аппендэктомию выполняли с использованием трехпортовой техники. ЛСА выполнена 26 пациентам (59%, средний возраст пациентов 32,9±1,3 года), традиционная ЛТА – 18 больным (41%, средний возраст пациентов 40,1±4,0 года, различие между способами аппендектомии статистически незначимо). Средний возраст пациентов в подгруппе с флегмонозным аппендицитом, которым была выполнена ЛСА, составил 32,4±1,5 лет, а среди пациентов, которым проведена ЛТА – 37,8±4,1 лет. В подгруппе пациентов с гангренозным аппендицитом, которым была выполнена ЛСА, составил 34,5±2,6 лет, а среди пациентов, которым проведена ЛТА – 40,8±4,7 лет. Различия по возрасту пациентов в зависимости от способа аппендэктомии статистически не значимы во всех подгруппах, за исключением подгруппы пациентов с аппендикулярным перитонитом, где выявлена статистически значимые различия (p<0,05) по возрасту между пациентами, которым выполнена ЛСА (28,5±2,5 лет) или ЛТА (41,5±3,7 лет). При любом варианте оперативного лечения деструктивного аппендицита, после санации брюшной полости операция завершалась дренированием брюшной полости и антибиотикотерапией в послеоперационном периоде, пропорциональной степени тяжести состояния пациента. Во время операции или после установки дренажей выполнялся забор перитонеального экссудата для бактериологического посева выпота и специальных биохимических методов исследование. При распространенном аппендикулярном перитоните, осложненном выраженным парезом ЖКТ и септическим шоком, применялся только лапаротомный доступ, а программа послеоперационного лечения проводилась в отделении реанимации и интенсивной терапии АМОКБ. У всех 44 пациентов опытной группы апостериорно диагноз деструктивного аппендицита подтвержден результатами патогистологического исследования.
От всех пациентов, участвовавших в исследовании, получено информированное письменное согласие. Исследование одобрено на заседании Этического комитетета ФГБОУ ВО Астраханский ГМУ МЗ РФ (протокол №23 от 30.11.2022 г.), соответствовало этическим стандартам, разработанным в соответствии с Хельсинкской декларацией.
В образцах сывороток крови и перитонеальном экссудате 44 больных с деструктивными формами аппендицита, наряду со стандартными клиническими, лабораторно-инструментальными методами исследования сопоставляли концентрации белка ЛФ и пептида ЛФЦ. Концентрацию ЛФ определяли набором реагентов для ИФА (Лактоферрин «Вектор-Бест» г. Новосибирск) с чувствительностью теста 1 нг/мл. Концентрацию ЛФЦ определяли с помощью, разработанного авторами способа получения моноспецифических кроличьих антител к пептиду лактоферрицину человека (патент РФ № 2795322) [9]. На основе полученных моноспецифических антител к лактоферрицину человека авторами сконструирована тест-система для иммуноферментного анализа ЛФЦ с чувствительностью теста 0,1 нг/мл.
Полученные данные обработаны методами описательной статистики с помощью программы Excel и представлены в таблице и графиках медианами (Me) и межквартильным размахом между 1 и 3 квартилями. Учитывая, что распределение в группах и подгруппах отличалось от нормального, достоверность различий между группами оценивали по непараметрическому критерию U Манна-Уитни. Различия считались достоверными при р < 0,05 .
3. Результаты исследования и их обсуждение
Данные сопоставления медиан концентраций лактоферрина и лактоферрицина в сыворотках крови у пациентов с различной степенью тяжести острого перитонита представлены в таблице (табл. 1).
Таблица 1 - Значения уровней ЛФ и ЛФЦ в сыворотках крови и перитонеальном экссудате у больных с деструктивным аппендицитом (медиана, межквартильный размах)
Группа больных | Кол-во | ЛФ экс нг/мл | ЛФ сыв нг/мл | ЛФЦ экс нг/мл | ЛФЦ сыв нг/мл |
Контроль (доноры) | n=40 | - | 1100 [938; 1250] | - | 0,203 [0,117; 0,280] |
Больных с флегмонозным аппендицитом | n=20 | 11060** [7730; 13850]
| 2900* [2138; 3638] 264% | 0,550 [0,203; 1,077]
| 0,415* [0,157; 0,657] 204% |
Больных с гангренозным аппендицитом | n=14 | 13600** [10360; 15540]
| 4250* [3400; 4850] 386% | 0,666 [0,390; 0,940]
| 0,522* [0,364; 0,717] 257% |
Больных с аппендикулярным перитонитом | n=10 | 14200** [10750; 16415]
| 4740* [2998; 5260] 431% | 0,829 [0,619; 1,168]
| 0,687* [0,592; 0,831] 338% |
Всего больных с деструктивным аппендицитом | n=44 | 12800** [10040; 15620]
| 3450* [2430; 4650] 314% | 0,666 [0,287; 1,069]
| 0,522* [0,283; 0,775] 257% |
Примечание: * – отмечены статистически достоверные различия с группой сравнения; ** – достоверные различия между уровнями в сыворотке и перитонеальном экссудате
Достоверные различия (p<0,05) со значениями медиан в контрольной группе 40 доноров установлены во всех группах пациентов с аппендицитом начиная от флегмонозных форм и кончая, аппендикулярным перитонитом, как для сывороточного ЛФ, так и для пептида ЛФЦ.
При этом при флегмонозном аппендиците уровни ЛФ и ЛФЦ превышали контрольные цифры на 264 и 204% соответственно, при гангренозном аппендиците уровни ЛФ и ЛФЦ превышали контрольные цифры на 386 и 257% соответственно и при аппендикулярном перитоните на 431 и 338% соответственно (в среднем группа из 44 больных с острым деструктивным аппендицитом отличалась от доноров в 3 раза и по ЛФ, и по ЛФЦ).
У пациентов, оперированных по поводу острого аппендицита, сопоставляли концентрации ЛФ и ЛФЦ в сыворотках крови, с жидкостью оттекающей по дренажам, установленным в брюшную полость. Концентрации белка в сыворотках и дренажной жидкости стандартизировали по концентрации белка. Установлено (табл. 1), что медианы концентрации ЛФ в перитонеальном экссудате всегда статистически достоверно (p<0,001) превышали сывороточные уровни ЛФ во всех группах пациентов с аппендицитом: при флегмонозном аппендиците в перитонеальном экссудате на 381% превышали контрольные цифры в сыворотке этих же больных, при гангренозном аппендиците в перитонеальном экссудате на 320% выше цифр в их же сыворотке и при аппендикулярном перитоните в перитонеальном экссудате на 300% выше цифр в сыворотке (в среднем группа из 44 больных с острым деструктивным аппендицитом отличалась от уровней ЛФ в перитонеальном экссудате этих же больных в 3,71 раза). Что касается лактоферрицина, то по этому пептиду различий у больных между концентрациями в сыворотке крови и перитонеальном экссудате ни в одном случае не установлено.
При изучении значений концентраций белка ЛФ и пептида ЛФЦ у пациентов с острым деструктивным аппендицитом нами установлено, что у всех пациентов цифры ЛФ и ЛФЦ многократно превышают контрольные цифры доноров и нарастают пропорционально степени тяжести состояния пациентов , , . Что касается сравнения концентраций белка ЛФ и пептида ЛФЦ в сыворотке крови и перитонеальном экссудате у пациентов с острым деструктивным аппендицитом нами установлено, что только цифры ЛФ в перитонеальном экссудате статистически достоверно в 3-4 раза превышают сывороточные уровни этих же больных, а цифры ЛФЦ в перитонеальном экссудате статистически достоверно от сывороточных уровней этих же больных не отличаются, разница в уровнях не превышает 120-133% , .
Обнаруженные различия в эффектах лактоферрина и лактоферрицина при хирургической абдоминальной патологии на примере острого деструктивного аппендицита требуют дополнительного углубленного изучения антимикробных свойств лактоферрицина. Установленные факты следует учитывать при определении тактики лечения пациентов с ургентной хирургической патологией.
4. Заключение
1. В данной работе нами показано, что при остром осложненном аппендиците, в том числе, осложненном перитонитом, наблюдаются статистически достоверное повышенные концентрации белка лактоферрина и пептида лактоферрицина относительно нормы и в сыворотке крови, и в перитонеальном экссудате.
2. У пациентов с острым деструктивным аппендицитом цифры лактоферрина в перитонеальном экссудате статистически достоверно в 3-4 раза превышают сывороточные уровни этих же больных, а цифры лактоферрицина в параллельных пробах между собой не отличаются.
3. По полученным в работе данным уровни ЛФ и ЛФЦ после лапароскопической аппендэктомии статистически достоверно не отличаются от уровней после лапаротомной аппендэктомии и зависят только от степени тяжести состояния пациентов.
4. Обнаруженные различия в эффектах лактоферрина и лактоферрицина при остром деструктивном аппендиците определяются различными механизмами антибактериального действия белка лактоферрина и пептида лактоферрицина. Более высокие цифры ЛФ в перитонеальном экссудате при деструктивном аппендиците, по сравнению с сывороточными концентрациями ЛФ, отражают роль железа в механизме бактерицидной и бактериостатической активности молекулы ЛФ в процессе транслокации эндогенного белка из кишечника в брюшную полость. У пептида ЛФЦ, не имеющего отношения к метаболизму железа, антимикробная активность связана со специфической структурой и аминокислотным составом ЛФЦ, проявляющейся в одинаковой степени и в крови, и в перитонеальном экссудате.