Бактерицидные свойства эфирных масел в отношении возбудителей респираторных болезней птиц
Бактерицидные свойства эфирных масел в отношении возбудителей респираторных болезней птиц
Аннотация
Изучена бактерицидная активность эфирных масел пихты, иссопа, кориандра, герани, сосны, мяты, шалфея, кедра, можжевельника, розмарина, кипариса, горной лаванды, эвкалипта, произведенных Алуштинским эфиромасличным совхоз-заводом на территории Республики Крым РФ в отношении некоторых возбудителей респираторных болезней птиц бактериальной этиологии – Salmonella enteritidis, Staphуlococcus aureus, Esсherichia coli, Pseudomonas aeruginosa.
В ходе эксперимента установили, что тест-культура Pseudomonas aeruginosa методом лунок была устойчива к большей части эфирных масел и проявляла чувствительность только к двум эфирным маслам – кипариса и эвкалипта. В отношении Staphylococcus aureus все исследуемые масла, кроме шалфея, обладали высокой бактерицидной активностью. Наибольшую зону задержки роста E. coli образовывали масла хвойных растений – пихты, кипариса и кедра. В отношении Salmonella enteritidis эфирные масла хвойных растений – пихты, кипариса, сосны и кедра также были более эффективны по сравнению с другими маслам.
Пары эфирных масел кориандра, пихты, иссопа, герани, мяты и горной лаванды полностью подавляли рост Staphylococcus aureus. Пары эфирных масел эвкалипта, иссопа и кориандра оказывали влияние на рост Pseudomonas aeruginosa, достоверно снижая его в 7,6, в 5,5 и в 7,2 раза соответственно. Рост кишечной палочки полностью подавлялся парами эфирных масел кориандра и пихты. Образец эфирного масла кедра полностью подавлял рост Salmonella enteritidis.
1. Введение
Респираторный синдром у птиц является одним из наиболее часто встречаемых симптомокомплексов. Одной из причин этому может быть патогенная и условно-патогенная бактериальная микрофлора. Поражения респираторных органов могут вызывать возбудители бактериальных инфекций – пастереллеза, орнитобактериоза, гемофилеза, микоплазмоза, хламидиоза, сальмонеллеза, колибактериоза, псевдомонноза, стафилококкоза, стрептококкоза и другие . Болеют птицы всех видов и возрастов. Основной путь заражения – аэрогенный. Полиэтиологичность болезней респираторного тракта и многофакторность их патогенеза обязывают проводить тщательную бактериологическую диагностику и, при разработке комплексных рекомендаций, предусматривать как специфические, так и неспецифические методы профилактики данной патологии.
Для лечения и профилактики бактериальных болезней птиц широко применяется антибиотикотерапия. Однако последнее время при бактериологическом исследовании птиц все чаще выделяются устойчивые к широкому спектру антибиотиков и химиопрепаратов штаммы микроорганизмов . Распространение таких штаммов усложняет контроль бактериальных инфекций. В связи с этим актуальным и значимым в настоящее время является поиск новых средств и методов борьбы с респираторными болезнями птиц бактериальной этиологии в промышленном птицеводстве.
Перспективным средством для решения этой проблемы могут стать биологически активные вещества растительного происхождения, в частности эфирные масла .
Эфирные масла, как антибиотические средства, известны очень давно. Это ароматические жидкости, получаемые из растительных материалов. По химической структуре они являются производными терпенов и их кислородосодержащих соединений – терпеноидов. Взаимодействуя с белками, они дестабилизируют ферментные системы, нарушают митохондриальную активность, разрушают окислительное фосфорилирование и тормозят образование макроэргических связей. Наличие терпеноидов, входящих в их состав, обусловливает выраженный бактерицидный эффект , . В состав эфирных масел также входят спирты, альдегиды, кетоны, простые и сложные эфиры, кислоты и другие соединения. Они обладают широким спектром антимикробного, антифунгального и антивирусного действия, являются иммуномодуляторами и стимулируют обменные процессы в организме животных .
Эфирные масла могут быть использованы для борьбы с антибиотико-резистентными микроорганизмами, так как не обладают мутагенными свойствами и не приводят к образованию морфологически-измененных форм бактерий, поэтому не вызывают устойчивости у микроорганизмов .
В последнее время появилось большое разнообразие препаратов на основе растительных компонентов. Эфирные масла входят в некоторые кормовые добавки, с их помощью проводят дезинфекцию инкубационного яйца , их используют для снятия теплового стресса птиц, вносят в пробиотические препараты. Установлено иммуномодулирующее действие фитопрепарата на основе эфирных масел при вакцинации , .
Целью нашей работы было исследовать бактерицидные свойства эфирных масел в отношении некоторых возбудителей респираторных болезней птиц бактериальной этиологии.
2. Методы и принципы исследования
В качестве материала для исследований использовали эфирные масла: пихты, иссопа, кориандра, герани, сосны, мяты, шалфея, кедра, можжевельника, розмарина, кипариса, горной лаванды, эвкалипта, произведенных из собственного сырья Алуштинским эфиромасличным совхоз-заводом на территории Республики Крым РФ.
В опытах in vitro методом лунок установили, обладают ли данные виды масел бактерицидной активностью в отношении возбудителей респираторных болезней птиц – Salmonella enteritidis, Staphуlococcus aureus, Esсherichia coli, Pseudomonas aeruginosa – музей рабочих культур отдела микробиологии ВНИВИП. Перед проведением экспериментов все описанные музейные штаммы освежали и подтверждали их культуральные, тинкториальные, морфологические и биохимические свойства. Совершали посев каждого микроорганизма на чашки Петри в МПА в объеме 1 см3 в концентрации Salmonella enteritidis – 2,7х109 КОЕ/см3; Staphуlococcus aureus – 7,5х109 КОЕ/см3, Esсherichia coli – 6,9х109 КОЕ/см3, Pseudomonas aeruginosa – 3,6х109 КОЕ/см3. После застывания агара в нем вырезали лунки диаметром 5 мм. Для предупреждения подтекания масел под агар, на дно лунки вносили по 1 капле расплавленного мясо-пептонного агара. Эфирные масла в чистом виде вносили в лунки – один вид масла на чашку с одним видом микроорганизма в три лунки – 1, 2, 3. Контролем на каждой чашке служила лунка, заполненная стерильным физиологическим раствором. Посевы термостатировали 24 часа при температуре 37,0°С. Зону задержки роста измеряли линейкой.
С целью определения бактерицидной активности паров эфирных масел использовали метод, предложенный Maruzzella и др. в 1959 году . На поверхность МПА вносили смыв суточной культуры тест-микроорганизмов по 0,2 см3 в концентрации Salmonella enteritidis – 2,7х109 КОЕ/см3; Staphуlococcus aureus – 7,5х109 КОЕ/см3, Esсherichia coli – 6,9х109 КОЕ/см3, Pseudomonas aeruginosa – 3,6х109 КОЕ/см3, Pasteurella multocida – 1,2х105. Посевы подсушивали. На крышку чашки Петри наносили 0,2 мл эфирного масла и распределяли его шпателем по всей поверхности крышки. Чашки дном вверх помещали в термостат при температуре 37,0°С. Подсчет выросших колоний проводили через 24, 48, 72 часа. Все опытные серии сопровождались посевами указанных микроорганизмов без добавления эфирных масел, что служило контролем в проведенном исследований.
Числовые данные обрабатывали статистически. При сравнении средних величин в нормально распределенных совокупностях количественных данных рассчитывали t-критерий Стьюдента. Полученные значения t-критерия Стьюдента оценивали путем сравнения с критическими значениями. Различия показателей считали статистически значимыми при уровне значимости p≤0,05.
3. Основные результаты
При изучении антимикробной активности масел нами был использован метод, основанный на диффузии эфирного масла в толщу агаровой среды, содержащей тест-культуру и подавление роста последней. Полученные нами результаты представлены в таблице 1.
Таблица 1 - Диаметр зоны задержки роста тест-микроорганизмов вокруг лунок с эфирными маслами (n=3)
№ п/п | Эфирное масло | Исследуемые тест-культуры, мм | |||
Pseudomonas aeruginosa | Staphylococcus aureus | Escherichia coli | Salmonella enteritidis | ||
1 | Кориандр | 0 | 12±0,5 | 0 | 11,0±0,3 |
2 | Пихта | 0 | 16±0,7 | 20 | 28±0,5 |
3 | Иссопа | 0 | 9 | 0 | 0 |
4 | Герань | 0 | 9±0,3 | 9 | 0 |
5 | Кипарис | 7±0,3 | 19±0,5 | 23±1,6 | 21,0±1,3 |
6 | Можжевельник | 0 | 18±0,5 | 14 | 14±0,7 |
7 | Сосна | 0 | 10±0,3 | 12±0,5 | 18±0,5 |
8 | Мята | 0 | 9±0,5 | 0 | 8±0,3 |
9 | Розмарин | 0 | 11±0,3 | 0 | 8 |
10 | Горная Лаванда | 0 | 9 | 0 | 0 |
11 | Шалфей | 0 | 0 | 0 | 0 |
12 | Кедр | 0 | 11±0,3 | 19±1,0 | 30±0,5 |
13 | Эвкалипт | 10±0,3 | 12±0,6 | 12 | 13 |
В ходе эксперимента установили, что тест-культура Pseudomonas aeruginosa методом лунок была устойчива к большей части эфирных масел и проявляла чувствительность только к двум эфирным маслам – кипариса и эвкалипта (рис. 3). Все исследуемые масла, кроме шалфея, обладали высокой бактерицидной активностью в отношении Staphylococcus aureus. Масла кипариса, можжевельника и пихты образовывали зону задержки роста тест-микроорганизма вокруг лунок до 19, 18 и 16 мм соответственно (рис. 2). E. coli в данном опыте была устойчива к половине исследуемых масел (рис. 5). Наибольшую зону задержки роста E. coli образовывали масла хвойных растений – пихты, кипариса и кедра. Ее диаметр составлял 20 мм, 23 мм и 19 мм соответственно. В отношении Salmonella enteritidis эфирные масла хвойных растений – пихты, кипариса, сосны и кедра также были более эффективны по сравнению с другими маслами (рис. 4). Диаметр зоны задержки роста Salmonella enteritidis вокруг лунки с маслом кедра составлял 30 мм. Результаты исследований по определению зоны задержки роста тест-микроорганизмов вокруг лунок с эфирными маслами представлены в виде графика (рис. 1).
Рисунок 1 - Диаметр зоны задержки роста тест-микроорганизмов вокруг лунок с эфирными маслами (n=3)
Рисунок 2 - Зона задержки роста Staphylococcus aureus вокруг лунок с эфирными маслами
Примечание: 1 – масло розмарина, 2 – шалфея, 3 – кориандра, 4 – горной лаванды, 5 – иссопа, 6 – мяты, 7 – сосны, 8 – кедра, 9 – пихты, 10 – кипариса, 11 – можжевельника
Рисунок 3 - Зона задержки роста Pseudomonas aeruginosa вокруг лунок с эфирными маслами
Примечание: 1 – масло можжевельника, 2 – кипариса, 3 – иссопа, 4 – герани, 5 – розмарина, 6 – шалфея, 7 – кориандра, 8 – пихты, 9 – горной лаванды, 10 – сосны
Рисунок 4 - Зона задержки роста Salmonella enteritidis вокруг лунок с эфирными маслами
Примечание: 1 – масло горной лаванды, 2 – розмарина, 3 – иссопа, 4 – мяты, 5 – шалфея, 6 – герани, 7 – кедра, 8 – можжевельника, 9 – кориандра, 10 – сосны, 11 – пихты
Рисунок 5 - Зона задержки роста Escherichia coli вокруг лунок с эфирными маслами
Примечание: 1 – масло горной лаванды, 2 – розмарина, 3 – герани, 4 – шалфея, 5 – кориандра, 6 – иссопа, 7 – сосны, 8 – мяты, 9 – кедра, 10 – пихты, 11 – можжевельника
Таблица 2 - Действие паров эфирных масел на рост тест-микроорганизмов (n=3)
Вид масла | Pseudomonas aeruginosa | Staphylococcus aureus | Escherichia coli | Salmonella enteritidis |
контроль | ||||
3,6±0,51x109 | 7,5±0,63x109 | 6,9±1,09x109 | 2,7±0,32x109 | |
Кориандр | 5,0±0,4 x108* | нет роста | нет роста | 7,1±0,75х103* |
Пихта | 2,0±0,41x109 | нет роста | нет роста | 3,3±0,62x108* |
Иссопа | 6,5±0,86x108* | нет роста | 3,5±0,95x107* | 2,8±0,92x105* |
Герань | 2,1±0,32x109 | нет роста | 4,0±0,81x109 | 2,6±0,77x109 |
Кипарис | 2,1±0,29x109 | 2,6±0,73х108* | 7,7±0,74x106* | 2,9±0,82x107* |
Можжевельник | 2,2±0,48x109 | 3,4±0,83х106* | 4,1±0,34x109 | 1,3±0,23x109*** |
Сосна | 2,4±0,07x109 | 1,9±0,49х109** | 6,1±0,88x109 | 2,0±0,43x109 |
Мята | 2,0±0,38x109 | нет роста | 5,0±0,59x108* | 1,1± 0,03x109** |
Розмарин | 1,7±0,14x109*** | 2,8±0,92х106* | 1,1±0,03x109* | 1,6± 0,4x109*** |
Горная лаванда | 2,2±0,36x109 | нет роста | 5,2±0,57x109 | 3,9± 0,35x108* |
Шалфей | 3,2±0,31x109 | 1,9±0,38х102* | 6,9±0,94x109 | 1,0±0,03x109*** |
Кедр | 1,0±0,3x109*** | 5,2±1,1х106* | 7,1±0,68x106* | нет роста |
Эвкалипт | 4,7±0,5х108* | 2,0±0,33х103* | 4,2±0,24х103* | 4,6±0,55х106* |
Примечание: * Р≤0,001; ** Р≤0,01; *** Р≤0,05
Установлено, что пары эфирных масел кориандра, пихты, иссопа, герани, мяты и горной лаванды полностью подавляли рост Staphylococcus aureus (рис. 6). А пары масел эвкалипта и шалфея снижали его рост в 3,7х106 и в 3,9х107 раза соответственно. Пары эфирных масел эвкалипта, иссопа и кориандра оказывали влияние на рост Pseudomonas aeruginosa, достоверно снижая рост в 7,6, в 5,5 и в 7,2 раза соответственно (рис. 7). Дезинфицирующим свойством в отношении Pseudomonas aeruginosa не обладало ни одно из исследуемых масел. Рост кишечной палочки полностью подавлялся парами эфирных масел кориандра и пихты (рис. 10). Пары эвкалипта снижали рост E. coli в 1,6х106, а кедра – в 971 раз (рис. 9). Образец эфирного масла кедра полностью подавлял рост Salmonella enteritidis (рис. 8), а пары масел кориандра, иссопа и эвкалипта обладали меньшей бактерицидной активностью и снижали рост сальмонелл в 3,8х105, в 9,6х103 и в 586 раз соответственно.
Рисунок 6 - Действие паров эфирных масел на рост Staphylococcus aureus (разведение 10-1)
Примечание: 1 – пары масла мяты, 2 – кориандра, 3 – горной лаванды, 4 – герани, 5 – пихты, 6 - контроль
Рисунок 7 - Действие паров эфирных масел на рост Pseudomonas aeruginosa (разведение 10-7)
Примечание: 1 – пары масла горной лаванды, 2 – сосны, 3 – герани, 4 – можжевельника, 5 – кипариса, 6 – мяты, 7 – кедра, 8 – иссопа, 9 – розмарина, 10 – пихты, 11 – кориандра, 12 – шалфея, 13 – контроль
Рисунок 8 - Действие паров эфирного масла кедра на рост Salmonella enteritidis (разведение 10-1)
Рисунок 9 - Действие паров эфирных масел на рост Escherichia coli (разведение 10-6)
Примечание: 1 – контроль, 2 – пары масла кипариса, 3 – горной лаванды, 4 – шалфея, 5 – розмарина, 6 – мяты, 7 – кедра, 8 – иссопа
Рисунок 10 - Действие паров эфирных масел на рост Escherichia coli (разведение 10-1)
Примечание: 1 – контроль, 2 – пары масла кориандра, 3 – пихты
4. Обсуждение
Проведенными исследованиями установлено, что S. aureus был более чувствителен к эфирным маслам, чем другие тест-культуры микроорганизмов. Это подтверждает сведения, что грамположительные бактерии более чувствительны к эфирным маслам, чем грамотрицательные . Низкую антибактериальную активность эфирных масел против грамотрицательных бактерий объясняют структурой внешней мембраны этих микроорганизмов, на которой гидрофильные цепи молекул полисахаридов образуют барьер для гидрофобных эфирных масел , . Однако наши исследования методом воздействия паров эфирных масел на тест-культуру показали, что масло кориандра и пихты в объеме 200 мкл полностью подавляло рост E. coli, а масло кедра – рост Salmonella enteritidis.
Проведенными исследованиями определено, что масла горной лаванды, герани и мяты образовывали одну из самых низких зон задержки роста S. aureus вокруг лунок с маслами – 9 мм, однако пары этих масел проявляли высокое бактерицидное действие и полностью подавляли рост золотистого стафилококка. И, напротив, масло кориандра не образовывало зоны задержки роста E. coli вокруг лунок, а пары этого масла полностью подавляли рост кишечной палочки. Также было отмечено, что вокруг лунок с маслом кипариса образовывалась значительная зона задержки роста E. coli в 23 мм, а действие паров на рост этой тест-культуры было сдерживающим и составило 7,7±0,74х106. Скорее всего это связано с различной способностью диффузии масел в агаре. Бактерицидное действие двумя методами подтверждалось у масла кедра в отношении S. enteritidis, а также у масла пихты в отношении E. coli. Масло кориандра и пихты показали наибольшую бактерицидную активность в отношении грамположительных и грамотрицательных тестируемых микроорганизмов.
5. Заключение
В ходе исследований установлено, что все исследуемые эфирные масла проявляли бактерицидную активность в отношении изучаемых микроорганизмов. Эфирные масла кориандра, пихты, иссопа, герани, мяты и горной лаванды в исследуемой концентрации полностью подавляли рост Staphylococcus aureus, а масла кориандра и пихты – рост Escherichia coli. Дезинфицирующим свойством в отношении Salmonella enteritidis обладали пары масла кедра. Рост Pseudomonas aeruginosa снижался под воздействием масел кориандра, иссопа, розмарина, кедра и эвкалипта.