ОЦЕНКА ОТНОСИТЕЛЬНОГО УРОВНЯ ЭКСПРЕССИИ ГЕНА BMP-2 У РАДУЖНОЙ ФОРЕЛИ В РАЗНОМ ВОЗРАСТЕ
ОЦЕНКА ОТНОСИТЕЛЬНОГО УРОВНЯ ЭКСПРЕССИИ ГЕНА BMP-2 У РАДУЖНОЙ ФОРЕЛИ В РАЗНОМ ВОЗРАСТЕ
Аннотация
Цель исследования – оценить относительный уровень экспрессии гена BMP-2 у радужной форели разных возрастных групп. Сбор биологического материала проводился на базе Федерального селекционно-генетического центра рыбоводства, расположенного в Ленинградской области. Объектом исследования были образцы тотальной РНК, полученные из разных тканей радужной форели породы рофор. Анализ корреляционных связей относительной экспрессии в ткани прямой кишки показал разнонаправленную зависимость уровня относительной экспрессии гена BMP-2 с показателями «масса тела» и «высотой тела» у рыб в возрасте 6 мес (P <0,05), а в ткани сердца с показателем длина головы в возрасте 6 мес (P <0,05). По остальным показателям были получены высокие значения коэффициента корреляции (r), однако статистически значимых значений не выявлено. Относительный уровень экспрессии гена BMP-2 в тканях прямого кишечника был незначительным разнонаправленным в группах радужной форели разного возраста. Экспрессионные изменения гена BMP-2 в тканях сердца показали, что экспрессия непостоянна у рыб разного возраста. В возрасте 6 и 12 месяцев отмечалось снижение уровня экспрессии с его достоверным повышением при достижении рыб возраста 18 месяцев и последующим снижением к возрасту 24 месяцев (P <0,05 и P <0,01). В результате чего было установлено, что в период активного роста радужной форели породы рофор уровень относительной экспрессии гена BMP-2 в тканях сердца значительно возрастал у рыб в возрасте 18 месяцев в сравнении с другими возрастными периодами (Р <0,05).
1. Введение
Аквакультура – на данный момент является активно развивающейся отраслью сельского хозяйства. Самым распространённым холодноводным объектом выращивания является радужная форель. Экономически важными показателями для хозяйств являются темпы роста рыбы. Экспрессия генов – процесс, в ходе которого наследственная информация от гена (последовательности нуклеотидов ДНК) преобразуется в функциональный продукт – РНК или белок.
Литературные данные свидетельствуют о том, что регуляторные гены, такие как гены факторов транскрипции и сигнальных молекул, обычно контролируются многими модульными, тканеспецифичными цис-регуляторными элементами, которые функционируют во время эмбриогенеза . Эти элементы часто находятся далеко от областей кодирования генов и их промоторов. Костные морфогенетические белки (BMPs – bone morphogenetics proteins) участвуют в регуляции многих процессов в онтогенезе, связанных с органогенезом и дифференцировкой тканей. Известны четыре члена семейства BMP: BMP-2, BMP-4, BMP-5 и GDF6, находящихся под контролем отдаленных цис-регуляторных элементов .
BMP-2 – костный морфогенетический белок (bone morphogenetic protein) относится к группе факторов роста, которые были открыты благодаря их способности воздействовать на формирование кости и хряща . Костный морфогенетический белок 2 (BMP-2) считается наиболее активным фактором остеогенеза. Он способствует пролиферации и дифференцировке клеток во время восстановления костей, а также индуцирует образование костей и хрящей in vivo , .
Таким образом, поиск сигнальных путей и изучение экспрессии генов рыб расширяет представление о молекулярных механизмах онто- и эмбриогенеза. А исследование семейства генов BMP дает представление о регуляции процессов развития организма при органогенезе, главным образом, формирование костной системы, и открывает перспективу влияния на размер выращиваемых гидробионтов.
2. Материалы и методы исследования
Объектом изучения были образцы тотальной РНК радужной форели. Были сформированы 4 группы радужной форели: 6 месяцев, 12 месяцев 18 месяцев и 24 месяца. С рыб были сняты размерно-весовые показатели: масса, длина по Смиту, длина до конца чешуйчатого покрова, длина головы, высота и толщина тела.
Для оценки относительного уровня экспрессии гена BMP-2 у рыб разного возраста были зафиксированы образцы мышечной ткани, ткани сердца и прямой кишки. Всего было зафиксировано 60 образцов. Образцы помещались в РНК стабилизирующий раствор «Фиксатор IntactRNA для стабилизации РНК в биологических образцах» («Евроген», Россия).
Выделение образцов тотальной РНК проводили с использованием коммерческого набора «ЛИРА+» для выделения РНК, ДНК и белков» («БИОЛАБМИКС», Россия).
Образцы ткани гомогенизировали на приборе Precellys 24 («Bertin», Франция) в присутствии реагента «ЛИРА» и далее следовали протоколу фирмы-производителя. Полученный раствор РНК хранили при температуре -80 °C. Все этапы работы проводили на льду для предотвращения деградации РНК. Концентрацию РНК оценивали на спектрофотометре NanoDrop 2000 Thermo FS («Thermo Fisher Scientific», США).
Для проведения ОТ-ПЦР-РВ были использованы реагенты коммерческой фирмы «БИОЛАБМИКС» (Россия). Анализировали уровень относительной экспрессии в образцах тканей прямой кишки и сердца. В качестве референсного образца использовался образец тканей мышц.
Таблица 1 - Праймеры для генов домашнего хозяйства и BMP-2
№ п/п | Название | Последовательность |
1 | G6PD | F-TCAAAGAGGGTCGGTTTCCG R-ACCCATCCCTCTTCCTCTCC |
2 | BMP-2 | F-AGCCACATTAAAGATCCACCAT R-GTGGGTATTGACGGTGGCAA |
Первичную обработку полученных данных при проведении ПЦР-РВ проводили при помощи программы QuantStudioтм Design&Analysis software v1.5.1. Для анализа уровня относительной экспрессии гена BMP-2 в тканях прямой кишки и сердца в качестве референса использовались образцы мышечной ткани. По результатам ПЦР-РВ генов домашнего хозяйства и оценки стабильности их экспрессии в качестве эндогенного контроля был выбран ген домашнего хозяйства G6PD. Расчет экспрессионных изменений гена BMP-2 выполняли методом ddCt (delta delta Cycle threshold) по формуле:
Описательная статистика представлена в виде Mean±SD. Статистическую значимость разницы оценивали путем вычисления критерия Краскела-Уоллиса. Визуализация данных проводилась в программе GraphPad Prism 8. Корреляционный анализ выполнен с применением критерия Спирмена.
3. Основные результаты
Рисунок 1 - Уровень относительной экспрессии гена BMP-2 в тканях прямого кишечника у рыб разного возраста
Примечание: ось Х возраст рыб, ось У 2^-(ddCt) уровень относительной экспрессии гена; KW-H – критерий Краскела-Уоллиса, p-уровень достоверности; данные представлены в виде Mean±SD; каждая точка на графике отражает уровень экспрессии гена BMP-2 в отдельном образце ткани прямого кишечника
Таблица 2 - Корреляционные связи уровня относительной экспрессии гена BMP-2 в тканях прямого кишечника с некоторыми размерно-весовыми показателям рыб
Показатель | Возраст рыбы | |||
6 мес | 12 мес | 18 мес | 24 мес | |
2^(-ddCt) (пр. киш) | ||||
2^(-ddCt) (сердце) | 0,667 | 0,500 | -0,154 | -0,500 |
Масса, г | -0,900* | -0,200 | 0,359 | -0,300 |
Длина по Смиту, см | -0,800 | -0,400 | 0,359 | -0,300 |
Длина тела до конца чешуйчатого покрова, см | -0,800 | -0,300 | 0,359 | -0,359 |
Длина головы, см | -0,527 | 0,154 | 0,359 | 0,700 |
Высота тела, см | -0,949* | -0,200 | 0,205 | -0,205 |
Толщина тела, см | -0,211 | -0,474 | 0,395 | -0,300 |
Мышечная масса | -0,700 | -0,200 | -0,051 | -0,400 |
Примечание: * P <0,05
Результаты анализа экспрессионных изменений гена BMP-2 в тканях сердца показали, что экспрессия не постоянна у рыб разного возраста (рисунок 2). В возрасте 6 и 12 мес. отмечалось снижение уровня экспрессии с его достоверным повышением при достижении рыб возраста 18 мес. и последующим снижением к возрасту 24 мес. (P <0,05 и P <0,01). Скорее всего у радужной форели в возрасте 18 мес., начинается процесс полового созревания рыбы, а также активной стадией роста. В группа возраста 12 и 18 мес. по 2 образца РНК деградировали и оценить уровень относительной экспрессии не удалось.
Рисунок 2 - Уровень относительной экспрессии гена BMP-2 в тканях сердца у рыб разного возраста
Примечание: ось Х возраст рыб, ось У 2^-(ddCt) уровень относительной экспрессии гена; KW-H – критерий Краскела-Уоллиса, p-уровень достоверности; данные представлены в виде Mean±SD; каждая точка на графике отражает уровень экспрессии гена BMP-2 в отдельном образце ткани сердца; * - P <0,05, **-P <0,01
Таблица 3 - Корреляционные связи уровня относительной экспрессии гена BMP-2 в тканях сердца с некоторыми размерно-весовыми показателям рыб
Показатель | Возраст рыбы | |||
6 мес | 12 мес | 18 мес | 24 мес | |
2^(-ddCt) (сердце) | ||||
2^(-ddCt) (пр. киш) | 0,667 | 0,500 | -0,154 | -0,500 |
Масса, г | -0,410 | -1,000 | -0,400 | -0,500 |
Длина по Смиту, см | -0,564 | -0,500 | -0,400 | -0,500 |
Длина до конца чешуйчатого покрова, см | -0,564 | -0,500 | -0,400 | -0,500 |
Длина головы, см | -0,973* | -1,000 | -0,600 | -0,500 |
Высота тела, см | -0,649 | -1,000 | -0,700 | -0,500 |
Толщина тела, см | -0,730 | -0,866 | -0,462 | 0,500 |
Мышечная масса | -0,154 | -1,000 | -0,200 | -0,500 |
Примечание: * P <0,05
Экспрессия гена BMP-2 в различных тканях исследовалась у человека, и различными авторами было отмечено, что наибольшая экспрессия этого гена наблюдалась в мышечных тканях, а также костной и соединительной ткани. В нашем случае были взяты мышечная ткань, ткани сердца и прямой кишки. Полученные нами результаты схожи с результатами экспериментов по оценки уровня экспрессии гена BMP-2 не только у человека, но и у других сельскохозяйственных животных , , , .
4. Заключение
Установлено, что в период активного роста радужной форели породы рофор уровень относительной экспрессии гена BMP-2 в тканях сердца значительно возрастал у рыб в возрасте 18 мес в сравнении с другими возрастными периодами (Р <0,05).