Pages Navigation Menu

ISSN 2227-6017 (ONLINE), ISSN 2303-9868 (PRINT), DOI: 10.18454/IRJ.2227-6017
ПИ № ФС 77 - 51217

DOI: https://doi.org/10.23670/IRJ.2017.57.068

Скачать PDF ( ) Страницы: 58-62 Выпуск: № 03 (57) Часть 3 () Искать в Google Scholar
Цитировать

Цитировать

Электронная ссылка | Печатная ссылка

Скопируйте отформатированную библиографическую ссылку через буфер обмена или перейдите по одной из ссылок для импорта в Менеджер библиографий.
Давлятшина Н. З. ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ ФЕРМЕНТОВ АНТИОКСИДАНТНОЙ СИСТЕМЫ У ПАЦИЕНТОВ С АТЕРОСКЛЕРОЗОМ РАЗНОЙ СТЕПЕНИ ВЫРАЖЕННОСТИ / Н. З. Давлятшина, С. Д. Маянская, А. Р. Мухаметгалиева и др. // Международный научно-исследовательский журнал. — 2017. — № 03 (57) Часть 3. — С. 58—62. — URL: https://research-journal.org/medical/ekspressiya-genov-fermentov-antioksidantnoj-sistemy-u-pacientov-s-aterosklerozom-raznoj-stepeni-vyrazhennosti/ (дата обращения: 26.06.2017. ). doi: 10.23670/IRJ.2017.57.068
Давлятшина Н. З. ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ ФЕРМЕНТОВ АНТИОКСИДАНТНОЙ СИСТЕМЫ У ПАЦИЕНТОВ С АТЕРОСКЛЕРОЗОМ РАЗНОЙ СТЕПЕНИ ВЫРАЖЕННОСТИ / Н. З. Давлятшина, С. Д. Маянская, А. Р. Мухаметгалиева и др. // Международный научно-исследовательский журнал. — 2017. — № 03 (57) Часть 3. — С. 58—62. doi: 10.23670/IRJ.2017.57.068

Импортировать


ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ ФЕРМЕНТОВ АНТИОКСИДАНТНОЙ СИСТЕМЫ У ПАЦИЕНТОВ С АТЕРОСКЛЕРОЗОМ РАЗНОЙ СТЕПЕНИ ВЫРАЖЕННОСТИ

  Давлятшина Н.З.1, Маянская С.Д.2, Мухаметгалиева А.Р.3, Кравцова О.А.4, Майкова Е.В.5

1ORCID:0000-0003-0265-1846, Аспирант кафедры госпитальной терапии с курсом эндокринологии, 2ORCID: 0000-0001-6701-5395, Доктор медицинских наук, профессор кафедры госпитальной терапии с курсом эндокринологии, ФГБОУ ВО «Казанский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения РФ, 3Магистрант кафедры биохимии и биотехнологии, 4Кандидат биологических наук, доцент кафедры биохимии и биотехнологии, 5Кандидат биологических наук, ассистент кафедры биохимии и биотехнологии, ФГАОУ ВО Казанский (Приволжский) федеральный университет

Исследование выполнено при финансовой поддержке РФФИ в рамках научного проекта №16-34- 00737

ЭКСПРЕССИЯ ГЕНОВ ФЕРМЕНТОВ АНТИОКСИДАНТНОЙ СИСТЕМЫ У ПАЦИЕНТОВ С АТЕРОСКЛЕРОЗОМ РАЗНОЙ СТЕПЕНИ ВЫРАЖЕННОСТИ

Аннотация

Целью данного исследования явилась оценка уровня экспрессии генов, участвующих в активации антиоксидантной системы (АОС) эндотелиальных клеток – SOD 1, SOD 2 и GPX 1 в периферической крови и в атеросклеротических бляшках (АБ) у 127 пациентов с атеросклерозом разной степени выраженности. Всем пациентам проводился анализ экспрессии генов SOD1, SOD2 и GPX1 в периферической крови; в 1-й группе – дополнительно анализировалась экспрессия генов в АБ, изъятых в ходе оперативных вмешательств из сонных артерий. У 40 пациентов диагноз мультифокального атеросклероза (МФА) подтвержден клинико-диагностическими методами (1 группа); у 40 человек ― ИБС, осложненная острым коронарным синдромом (ОКС) (2 группа) и у 38 чел. ― без клинических признаков атеросклероза, но с наличием факторов риска (ФР) развития сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ) (3 группа). Анализ экспрессии генов проводили относительно контрольной группы (9 чел.), куда вошли пациенты без признаков сердечно-сосудистой патологии. В нашем исследовании в группе больных с ОКС и МФА экспрессия генов SOD 1 была снижена, что вероятно свидетельствовало об истощении эндогенного антиоксидантного потенциала в процессе развития осложнений атеросклеротического процесса. В группе пациентов с наличием ФР развития ССЗ наблюдается незначительная активация генов SOD 1.При анализе атеросклеротических бляшек экспрессия генов SOD 1,  GPX 1  методами ПЦР не выявлена.

Ключевые слова: антиоксидантная система, экспрессия генов SOD 1, SOD 2,  GPX 1, мультифокальный атеросклероз, факторы риска, острый коронарный синдром.

Davlyatshina N.Z.1, Mayanskaya S.D.2, Muhametkalieva A.R.3Kravtsova O.A.4Maykova Е.В.5

1ORCID: 0000-0003-0265-1846, Postgraduate student of the Department of hospital therapy, 2ORCID: 0000-0001-6701-5395, MD, Professor of the Department of hospital therapy, Kazan state medical University, 3Undergraduate student of the Department of biochemistry and biotechnology, 4PhD in Biology, associate professor, of the Department of biochemistry and biotechnology, 5PhD in Biology, assistant of professor of the Department of biochemistry and biotechnology, Kazan Federal University

GENE  EXPRESSION OF ANTIOXIDANT ENZYMES IN PATIENTS WITH ATHEROSCLEROSIS OF DIFFERENT SEVERITY

Abstract

The aim of this study was to assess the level of expression of genes involved in the activation of the antioxidant system (AOS) endothelial cells – SOD 1, SOD 2, GPX 1 in the peripheral blood and in atherosclerotic plaques (AP) in  127 patients with atherosclerosis of varying severity. All patients performed gene expression analysis of SOD1, SOD2 GPX1 and in the peripheral blood; in the 1st group – in addition analyzed gene expression in AP seized during surgical procedures of the carotid arteries. In 40 patients, the diagnosis of multifocal atherosclerosis (MFA), confirmed by the clinical and diagnostic methods (group 1); 40 patients – coronary heart disease complicated by acute coronary syndrome (ACS) (group 2) and 38 patients – without clinical signs of atherosclerosis, but with the presence of risk factors (RF) to develop cardiovascular disease (CVD) (group 3). Gene expression analysis was performed with respect to the control group (9 pers.), which included patients with no evidence of cardiovascular disease. In our study, in patients with ACS and MFA gene expression SOD 1 was reduced that is possibly indicate on depletion of the endogenous antioxidant potential in the development of atherosclerosis complications. In the group of subjects with CVD RF minor activation observed SOD 1 gene. In the analysis of AP gene expression SOD 1, GPX 1 PCR methods are not found.

Keywords: antioxidant system, expression of genes  SOD 1, SOD 2,  GPX 1, multifocal atherosclerosis, risk factors, acute coronary syndrome.

Введение. Многочисленные исследования показали, что изменение генной экспрессии играет важную патофизиологическую роль в развитии и прогрессировании сердечно-сосудистых заболеваний (ССЗ).  Проблема атеросклероза (АС) является одной из самых актуальных в современной медицине в связи с его широкой распространенностью, продолжительностью латентного периода течения и выраженностью неблагоприятных исходов. Одним из структурных компонентов клетки являются липиды, которые очень легко поддаются окислению активными формами кислорода (АФК). В нормальных физиологических условиях небольшие количества кислорода постоянно конвертируются в супероксид-анионы, перекись водорода и гидроксильные радикалы. Избыточная продукция этих радикалов выступает в роли фактора повреждения, компенсаторным механизмом которого является эндогенная антиоксидантная система (АОС) организма.  АОС человека  – это система, блокирующая образование  АФК [1]. Главный компонент этой системы – сеть ферментов АОС: супероксиддисмутаза (SOD), глютатионпероксидаза (GPX), каталаза (CAT) и параоксоназа (PON) [2]. При этом активность ферментов эволюционно и генетически запрограммирована для оптимизации баланса окислительных процессов и активности систем антиокислительной защиты. Нарушение баланса между про- и антиоксидантной системами организма приводит к развитию окислительного стресса, что в комплексе с наличием гиперлипидемии создает благоприятные условия для развития АС. С точки зрения физиологии гены АОС, в частности гены, кодирующие различные изо­формы супероксиддисмутазы (SOD), каталазу и глута­тионпероксидазу (GPX), выполняющие антиоксидант­ную функцию, могут иметь большое значение в формировании генетически детерминированной предрасположенности к различным клиническим формам АС (стенокардия, острый ин­фаркт миокарда (ИМ), мозговой инсульт). Тем не менее патогенетические факторы и механизмы дисрегуляции работы АОС при АС разной локализации еще недостаточно исследованы, а результаты исследований носят противоречивый характер. Таким образом, в настоящее время представляется актуальной комплексная оценка вклада генетических маркеров в изменение активности АОС у пациентов с проявлениями АС разной локализации и степени выраженности.  Целью данного исследования явилась оценка уровня экспрессии генов, участвующих в активации АОС эндотелиальных клеток – SOD 1, SOD 2 и GPX 1 в периферической крови и в атеросклеротических бляшках (АБ) у пациентов с АС разной степени выраженности.

Материалы и методы исследования. Обследовали 127 человек, в возрасте от 30 до 75 лет, не состоящих в родстве и сопоставимых по социально – экономическому и этническому статусу. Включение больного в исследование осуществлялось после получения информированного согласия, в том числе на проведение – генетического тестирования. Протокол исследования одобрен локальным этическим комитетом ФГБОУ ВО КГМУ Министерства здравоохранения РФ. В зависимости от степени выраженности клинических и морфологических проявлений АС пациенты были разделены на 3 группы: 1) 40 пациентов, с подтвержденным клинико-диагностическими методами, диагнозом мультифокального атеросклероза (МФА); 2) группа больных с ИБС, осложненной острым коронарным синдромом (ОКС) (40 чел.); 3) пациенты без клинических признаков атеросклеротического поражения сосудов, но с наличием факторов риска (ФР) развития ССЗ (38 чел.).  Группа контроля представлена популяционной выборкой из 9 человек (5 женщин и 4 мужчин), жителей г. Казани, без наследственной отягощенности, ФР и клинических проявлений ССЗ. Обследование контрольной группы включало: измерение АД, антропометрию (рост, вес), социально-демографические характеристики, опрос о курении, потреблении алкоголя (частота и типичная доза), уровне физической активности, оценка липидного профиля (общий холестерин (ОХ), триглицериды (ТГ), липопротеиды низкой плотности (ЛПНП) и липопротеиды высокой плотности (ЛПВП). Всем пациентам проводился анализ экспрессии генов SOD1, SOD2 и GPX1 в периферической крови; в 1-й группе – дополнительно анализировалась экспрессия генов в АБ из сонных артерий, изъятых в ходе оперативных вмешательств. Критериями исключения служили: тяжелые сопутствующие заболевания, аутоиммунные болезни, диагностированные опухоли, психические заболевания, отказ от генетического тестирования. На каждого больного заполнялась специально разработанная клиническая карта.

Выделение тотального препарата РНК проводили из 100 мкл цельной крови, взятой с антикоагулянтом ЭДТА, с использованием TRiZol (Invitrogen, США) согласно инструкции фирмы-производителя. Количественную оценку выделенных образцов РНК проводили спектрофотометрическим методом на NanoPhotometer P360 (IMPLEN, Германия). Для синтеза кДНК проводили реакцию обратной транскрипции с использованием коммерческого набора MMLV RT kit (Евроген, Россия). Анализ экспрессии генов SOD1, SOD2 и GPX1 проводили методом ПЦР в реальном времени на амплификаторе CFX96 (BioRad, США) с использованием коммерческих наборов зондов и праймеров согласно протоколу фирмы-производителя (Applied Biosystems, США). В качестве референтного гена использовали ген бета-актина. Относительный уровень экспрессии генов (RQ) рассчитывали с использованием метода, предложенного Livak К. и Schmittgen T.[3]. Достоверность различий определялась с использованием непараметрического статистического критерия Стьюдента (t-тeста), различия считались достоверными при р <0,05. Статистический анализ данных проводили с применением стандартных программ Microsoft Excel, 2010.

Результаты и обсуждение. Группы обследованных пациентов были сопоставлены по основным демографическим, антропологическим показателям, наличию ФР АС, сопутствующей патологии, распространенности атеротромботических событий в анамнезе, данным лабораторного и инструментального обследования. Больные МФА, с поражением от трех сосудистых бассейнов и более составили группу 1. Среди них преобладали: 53,1 % ― с перенесенными мозговыми инсультами, 27 % ― с критическими стенозами артерий нижних конечностей, 48,7% ― с хроническими формами ИБС. Среди больных с МФА преобладали мужчины (90 %). У всех больных с МФА изучалась частота основных сердечно-сосудистых ФР: артериальная гипертензия (АГ), курение, гиперхолестеринемия (ГХС) (общий холестерин >5,5 ммоль/л), отягощенная наследственность (по АГ, ИБС) и абдоминальное ожирение (АО) (табл. 1). Вторая группа была представлена пациентами, поступившими в отделение неотложной кардиологии с клиникой ИБС, осложненной ОКС, из них 24 человек (60 %) с подъемом и 16  человек (40 %) без подъема сегмента ST, имели также наличие всех основных сердечно-сосудистых ФР ― АГ, АО и ГХС, курение. В этой группе пациентов гемодинамически значимых стенозов сонных и периферических артерий выявлено не было. В третьей группе были пациенты с ФР развития ССЗ, такими как, курение, дислипидемия, гипертриглицеридемия, АГ, ожирение, компенсированный сахарный диабет, гиподинамия. У 21 пациента наблюдалось до  трех ФР развития ССЗ (55,3 %), больше трех ФР развития ССЗ ― у 17  человек (44, 7 % ).

 

Таблица 1 –  относительный уровень (RQ) экспрессии генов SOD1, SOD2 и GPX1

  SOD1  SOD2 GPX1
RQ* р** RQ р RQ р
1 группа

(МФА) кровь

0,0445

 

0,03

 

 

0,03945

 

0,009 0,31

 

0,004

 

2 группа

(МФА) АБ

 – 0,0033 0,0003
3группа (ИБС, ОКС) 0,0037

 

0,005 0,092

 

0,03 0,206

 

0,017
4 группа (ФР) 0,208

 

0,103

 

3,28

 

0,24 0,303

 

0,02

Примечание: * ― во сколько раз изменяется экспрессия целевых генов у исследуемых групп относительно контроля, взятого за 1; ** ― уровень статистической значимости по сравнению с контролем.

Как известно роль SOD заключается в ускорении реакции превращения токсичного для организма кислородного радикала – супероксида – в перекись водорода и молекулярный кислород. Наиболее значимы в развитии предраспо­ложенности к атеросклерозу полиморфные варианты ге­нов супероксиддисмутазы (SOD1, SOD2 и SOD3). SOD1 – локализуется в основном в цитозоле эритроцитов, межмембранном пространстве митохондрий, цитоплазме и ядре нервных клеток [4]. Изменение содержания SOD эритроцитов является важным фактором в развитии атеросклероза сосудов наряду с дис­липидемией и другими факторами [5]. Согласно нашим данным, у пациентов с разной степенью выраженности АС показатели экспрессии гена SOD1 ―  были существенно ниже относительно контроля. В группе пациентов с наличием ФР развития ССЗ наблюдалась незначительная активация данного гена SOD 1, при этом в группе больных с ОКС  экспрессия гена  SOD1 была резко снижена, что, по-видимому, свидетельствует о катастрофическом истощении системы АОС в условиях острого повреждения миокарда.   При анализе АБ экспрессия данного рецептора методами ПЦР не выявлена (табл.  1).

Митохондриальная SOD 2 играет важную роль в ограничении окислительного стресса и дисмутирует супероксидные радикалы в перекись водорода, которая далее разлагается цитоплазматической каталазой, вследствие чего образуется вода [6].  SOD 2  локализована в митохондриях печени и миокарда эукариот, вблизи анионных каналов, состоит из четырёх субъединиц с молекулярной массой 20 000 Да каждая. Целый ряд исследований посвящён анализу экспрессии  SOD 2. В одной из таких работ было показа­но, что сверхэкспрессия SOD2 защищает транс­генных мышей от развития ишемии головного мозга [7]. Кроме того, сверхэкспрессия SOD2 по­давляет окисление ЛПНП в эндотелиальных клетках in vitrо [8]. В нашем исследовании экспрессия гена SOD 2  наблюдалась во всех  группах пациентов. При этом ее уровень   был значительно выше в крови у пациентов с наличием ФР, таких как ожирение, дислипидемия, курение и АГ по сравнению с другими группами. При этом у пациентов с МФА в АБ и в периферической крови  относительный уровень экспрессии гена  SOD 2 имеет тенденцию к снижению , что, возможно, связано с постепенным снижением активности АОС в целом у пациентов с генерализованным  АС (табл. 1)

GPX — семейство ферментов, защищающих организм от окислительного повреждения. Они осущест­вляют восстановление перекисей липидов в со­ответствующие спирты и восстановление перок­сида водорода до воды.  Существует несколько изоферментов, которые кодируются разными генами. Изоферменты отличаются по локализации в клетке и субстратной специфичности. GPX 1 –  наиболее распространенная форма фермента, обнаружена в цитоплазме практически всех тканей млекопитающих, субстратом GPX 1 является пероксид водорода [9]. В ходе ряда исследова­ний была выявлена сниженная активность фер­мента GPX 1 в плазме крови при сердечно-сосудистых заболеваниях разной этиологии. Результаты исследований последних лет по­казали, что носительство мутантного аллеля T (генотипы ТТ и СТ) полиморфного варианта +593С/T гена GPX 1 связано с повышенным риском развития сердечно-сосудистой патологии, в том числе ишемического инсульта и ишемии миокарда [10]. При анализе исследуемого гена, где регистрировалось достоверное снижение экспрессии гена GPX 1   во всех группах пациентов, причем наиболее значительное было у больных с ИБС, осложненной ОКС, что говорит о возможном истощении экспрессионной активности гена GPX 1 и, вероятно, может свидетельствовать об истощении антиоксидантного потенциала в процессе развития осложнений АС.

Заключение. Таким образом, исследование генов ― регуляторов антиоксидантной системы представляется перспективным направлением и требует дальнейшего изучения. При этом, учитывая их определенную связь с различными проявлениями атеросклероза, оценка экспрессии генов, регулирующих разные эндогенные антиоксиданты, может иметь прогностическое значение и позволит решать вопросы профилактики и новых методов лечения.

Список литературы / References

  1. Колесникова Л. И. и др. Вестник Военно-медицинской академии / Л.И. Колесникова , Н. А. Курашова, Л. А. Гребенкина / / Вестник Академии военной медицины. – 2012. – № 3. – С. 134-137.
  2. Колесникова Л. И. и др. Журнал акушерства и женских болезней / Л. И. Колесникова и др.// – Журнал акушерства и женских болезней. – 2008; LVII(1). – С. 52-56.
  3. Livak, K. J. Analysis of Relative Gene Expression Data Using Real- Time Quantitative PCR and the 2-ΔΔCt Method / K. J. Livak, T. D. Schmittgen // Methods. – 2001. – Vol. 25(4) – P. 402-408.
  4. Chen Z. et al. Over expression of MnSOD protects against myocardial ischemia reperfusion repercussion injury in transgenic mice /Z. Chen, B. Siu, R.Vincent et al. // Mol. Cell Cardiol. — 1998. — Vol. 30. — P. 28–49
  5. Zawadzka-Bartczak E. Activities of red blood cell anti-oxidative enzymes (SOD, GPx) and total anti-oxidative capacity of serum (TAS) in men with coronary atherosclerosis and in healthy pilots / Zawadzka-Bartczak  // Med. Sci. — 2005. — Vol. 11, N 9. — P. 440–444.
  6. Mоllsten A. et al. The V16A polymorphism in SOD2 is associated with increased risk of diabetic nephropathy and cardiovascular disease in type 1 diabetes/ A. Mоllsten, A. Jorsal, Lajer   et al.   // Springer-Verlag. — 2009. — Vol. 23. — P. 345.
  7. Chen Z. et al. Over expression of MnSOD protects against myocardial ischemia reperfusion repercussion injury in transgenic mice / Z. Chen, B. Siu, R. Vincent et al.   // Mol. Cell Cardiol. — 1998. — Vol. 30. — P. 28–49.
  8. Roest M. et al. Genetic and environmental determinants of the PON–1 phenotype. /M.Roest, T.M. van Himbergen, A.B. Barendrecht  et al //  Eur J Clin Invest.  – 2007. – Vol. 37 (3). –  Р. 87–196.
  9. Arsova-Sarafinovska Z. et al. Glutathione peroxidase 1 (GPX1) genetic polymorphism, erythrocyte GPX activity, and prostate cancer risk. / Z. Arsova-Sarafinovska, N. Matevska,  Eken  et al. // Int. Urol. Nephrol. – 2009. – Vol. 41 (1). – Р. 63–70.
  10. Suzen H.S. et al. CAT C-262T and GPX1 Pro198Leu polymorphisms in a Turkish population. / H.S. Suzen, E. Gucyener, O. Sakalli et al .// Mol Biol Rep.  – 2010. – Vol. 37 (1). –  Р. 87–92

Список литературы на английском языке / References in English

  1. Kolesnikova L.I. et al. Vestnik voenno-meditsinskoi akademii [ Vestnik voenno-meditsinskoi akademii] /  I. Kolesnikova, N.A, Kurashova,  L.A. Grebenkina // Vestnik voenno-meditsinskoi akademii [  Bulletin of Academy of Military Medicine ]   – 2012. – № 3. – Р. 134–137 [in Russian]
  2. Kolesnikova L.I. et al. Zhurnal akusherstva i zhenskikh boleznei [Journal of obstetrics and women’s diseases]/ L.I Kolesnikova et al.//  – Journal of obstetrics and women’s diseases. – 2008; LVII(1). – Р. 52–56. [in Russian]
  3. Livak, K. J. Analysis of Relative Gene Expression Data Using Real- Time Quantitative PCR and the 2-ΔΔCt Method / K. J. Livak, T. D. Schmittgen // Methods. – 2001. – Vol. 25(4) – P. 402-408.
  4. Chen Z. et al. Over expression of MnSOD protects against myocardial ischemia reperfusion repercussion injury in transgenic mice /Z. Chen, B. Siu, R.Vincent et al. // Mol. Cell Cardiol. — 1998. — Vol. 30. — P. 28–49
  5. Zawadzka-Bartczak E. Activities of red blood cell anti-oxidative enzymes (SOD, GPx) and total anti-oxidative capacity of serum (TAS) in men with coronary atherosclerosis and in healthy pilots / Zawadzka-Bartczak  // Med. Sci. Monit. — 2005. — Vol. 11, N 9. — P. 440–444.
  6. Mоllsten A. et al. The V16A polymorphism in SOD2 is associated with increased risk of diabetic nephropathy and cardiovascular disease in type 1 diabetes/ A. Mоllsten, A. Jorsal, Lajer   et al.   // Springer-Verlag. — 2009. — Vol. 23. — P. 345.
  7. Chen Z. et al. Over expression of MnSOD protects against myocardial ischemia reperfusion repercussion injury in transgenic mice / Z. Chen, B. Siu, R. Vincent et al.   // Mol. Cell Cardiol. — 1998. — Vol. 30. — P. 28–49.
  8. Roest M. et al. Genetic and environmental determinants of the PON–1 phenotype. /M.Roest, T.M. van Himbergen, A.B. Barendrecht  et al //  Eur J Clin Invest.  – 2007. – Vol. 37 (3). –  Р. 87–196.
  9. Arsova-Sarafinovska Z. et al. Glutathione peroxidase 1 (GPX1) genetic polymorphism, erythrocyte GPX activity, and prostate cancer risk. / Z. Arsova-Sarafinovska, N. Matevska,   Eken  et al. // Int. Urol. Nephrol. – 2009. – Vol. 41 (1). – Р. 63–70.
  10. Suzen H.S. et al. CAT C-262T and GPX1 Pro198Leu polymorphisms in a Turkish population. / H.S. Suzen, E. Gucyener, O. Sakalli et al .// Mol Biol Rep.  – 2010. – Vol. 37 (1). –  Р. 87–92

Оставить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *

Лимит времени истёк. Пожалуйста, перезагрузите CAPTCHA.