1. Введение

Обмен минеральных элементов у пушных зверей и, в частности, у песцов является важной частью всего метаболизма, обеспечивающего качество меха, продуктивность и здоровье животных. В промышленном звероводстве у песцов, являющихся плотоядными животными с хищной направленностью, основу рационов составляют животные субпродукты и злаки, поэтому физиологическое обоснование обмена минеральных веществ на уровне пищеварительного тракта имеет прикладное значение, так как именно здесь происходят ключевые процессы их высвобождения и абсорбции.

Среди эссенциальных элементов особый интерес представляет обмен кальция. Однако в настоящее время большинство работ по его обмену у плотоядных затрагивают общие системные показатели костной минерализации, концентрацию в сыворотке крови или клинические аспекты гипокальциемии [1][2][3]. При этом у песцов, как хищных млекопитающих с относительно коротким тонким кишечником и высокой реабсорбцией минералов и воды в толстом отделе, имеются структурные особенности организации химуса как динамической среды, а обмен кальция определяется доступностью и соотношением растворимых ионизированных форм, ассоциированных с эндогенными компонентами и связанных с непереваренным кормом.

Современные представления о кишечном гомеостазе кальция, базирующиеся на процессах трансклеточного, витамин D-зависимого, параклеточного, пассивного и концентрационно-зависимого всасывания, не учитывают физико-химические особенности химуса в разных отделах, соотношение эндогенного и экзогенного пулов кальция в энтеральной среде [4][5]. Однако в ряде фундаментальных работ установлено, что муциновый слой кишечника выступает не только как барьер, но и как ионообменная матрица, способная связывать двухвалентные катионы, включая Ca²⁺, за счёт карбоксильных и сульфатных групп сиаломуцинов и сульфомуцинов [6]. У хищников доля эндогенного кальция в химусе может достигать 50% от общего содержания в дистальных отделах. Эта кумуляция носит обратимый характер и зависит от рН, ионной силы и осмотического градиента [7]. Таким образом, связывая до 30–40% поступившего из корма кальция у плотоядных, кишечная слизь является не просто инертным секретом, а участвует в формировании и ионном гомеостазировании энтеральной среды [8].

Установлено, что у хищных млекопитающих, к которым относятся песцы, всасывание воды и электролитов происходит неравномерно с максимальной секрецией пищеварительных соков в дуоденуме и максимальной абсорбцией в дистальных отделах тонкой кишки [9]. Именно эта регионарность определяет концентрационные градиенты сухого вещества, что напрямую влияет на растворимость кальциевых солей и их доступность для трансмембранного переноса. Также стоит отметить, что у псовых значительная часть кальция связывается с непереваренными волокнами и бактериальной биомассой, образуя так называемый «кишечный резервуар», замедляющий абсорбцию и выполняющий буферную функцию [10]. В исследованиях на песцах показано, что диета с высоким содержанием соединительной ткани приводит к увеличению непереваренных частиц в химусе, которые, в свою очередь, служат адсорбентами для кальция [11].

Рационы пушных зверей традиционно содержат большое количество животных белков, жиров и злаковых компонентов, что создаёт специфический субстрат для микробной ферментации. Микробиота толстого отдела кишечника у песцовых в основном представлена бактериями родов Bacteroides, Clostridium и Lactobacillus, способными продуцировать фитазы и уреазы, расщепляющие кальцийсодержащие комплексы. Их активность обеспечивает до 20% высвобождения связанного кальция при гидролизе полисахаридов и снижении рН с резким ростом его растворимых форм в просвете слепой и ободочной кишки [12][13].

На основании вышеуказанных сведений целью настоящего исследования стало изучение структурно-функциональных особенностей химуса и энтерального метаболизма кальция у песцов с акцентом на региональные различия в тонком и толстом кишечнике. Полученные данные позволят расширить фундаментальные знания о полостном пищеварении и метаболизме кальция у плотоядных млекопитающих семейства псовых в эволюционно-адаптивной стратегии всеядного типа питания.

2. Методы и принципы исследования

Исследования проводились на кафедре физиологии, этологии и биохимии животных РГАУ-МСХА имени К.А. Тимирязева с соблюдением биоэтических норм и правил. Эксперимент проводили на песцах в количестве 3 голов, отобранных из Пушкинского зверосовхоза ФГПУ «Русский соболь». Животные содержались одиночно в клетках с соблюдением зоогигиенических, зоотехнических и ветеринарных требований. Кормление осуществлялось в виде жидкой мешанки из смеси злаков и субпродуктов животного происхождения без включения дополнительных добавок, состав которой варьировался в соответствии с рационом. Убой производился в конце периода выращивания в соответствии с биоэтическими нормами методом эвтаназии путем внутримышечной инъекции дитилина 2% по 0,4 мл на одну голову животного.

После убоя у всех животных производили извлечение пищеварительного тракта с разделением на желудок, двенадцатиперстную, тощую, подвздошную, слепую и ободочную кишку. Из каждого отдела извлекали образцы химуса и стенки кишечника. Образцы химуса фракционировали на эндогенные и экзогенные компоненты по методике, разработанной на кафедре физиологии и биохимии животных РГАУ-МСХА им. К.А. Тимирязева [14]. В результате разведения химуса элюентом с последующим декантированием и центрифугированием получали пищевые частицы, или непереваренный остаток корма (НОК), супернатант, или надосадочную жидкость — растворимую фракцию химуса (РФ), и центрифугат, или плотную эндогенную фракцию (ПЭФ), которая представлена муцинами полостной кишечной слизи, слущенными энтероцитами, пищеварительными ферментами на факультативной основе и симбиотической бактериальной массой. После высушивания всех анализируемых проб при температуре 105 °С расчетным методом вычисляли долю каждой фракции в сухом веществе химуса. Стенку кишечника разделяли на слизистый слой (СС) и серозно-мышечный слой (СМС). По методике Б.В. Питрана за счет механической вибрации вывернутого участка кишечника в элюенте смывали поверхностный и относительно рыхло связанный слой слизистых наложений без отслоения самого эпителиального пласта, а полученный супернатант центрифугировали, получая слой слизистых наложений (ССН).

Во всех образцах методом атомно-абсорбционной спектрофотометрии определяли содержание кальция. Статистическую обработку проводили на основе средних арифметических и стандартных ошибок с применением двухфакторного дисперсионного анализа.

3. Основные результаты

Анализ сухого вещества химуса песцов показал, что минимальная концентрация сухого вещества отмечена в химусе двенадцатиперстной и тощей кишке — 14,2–15,8%, которая затем постепенно увеличивалась до 19% в подвздошной кишке, достигая максимальных значений в слепой и ободочной кишке — 27,7–31% — вследствие преобладания абсорбции воды и растворенных нутриентов над секрецией пищеварительных соков. Количественная фракционная оценка сухого вещества химуса кишечника песцов показывает, что это гетерогенная структурированная система с набором эндогенных и экзогенных компонентов, образующих специфическую энтеральную среду, которая трансформируется в виде проксимально-дистального градиента по мере продвижения по кишечнику. Доля растворимой фракции в сухом веществе химуса двенадцатиперстной кишки является максимальной, составляя 67,5%, что коррелирует с интенсивной секрецией пищеварительных соков для ферментативного гидролиза и обеспечения низкой вязкости для улучшения всасывания нутриентов (табл. 1). В конце тонкого и в толстом отделах кишечника её доля закономерно снижается до 41% и 12%, что, несомненно, обусловлено активным всасыванием низкомолекулярных продуктов гидролиза. Напротив, количество непереваренных частиц корма в сухом веществе химуса закономерно возрастает с минимальных значений (9,5%) в двенадцатиперстной кишке до максимальных в ободочной кишке (71%), где начинается накопление непереваренных пищевых волокон для последующей их обработки симбиотической микрофлорой толстого отдела кишечника. Скопление НОК в дистальных отделах обусловлено наличием в рационе песцов костных остатков. Доля плотной эндогенной фракции остается относительно стабильной в диапазоне 14–23%. Таким образом, начиная с тонкого отдела кишечника, начинается последовательная «очистка» химуса от растворимых компонентов, что делает его более грубым и плотным к илеоцекальному переходу за счет частиц корма и плотной эндогенной полостной кишечной слизи.

Коэффициент отношения РФ/ПЭФ в химусе песцов отражает баланс между пищеварительной ёмкостью и барьерной функцией. Значение от 2,9 до 4 в тонком отделе кишечника интерпретируется как адекватная ферментативная нагрузка с преобладанием ферментативного переваривания над слизеобразованием. Максимальное это отношение 4,0 у песцов отмечается в тощем кишечнике. Коэффициент РФ/НОК это прямой показатель эффективности переваривания твёрдой фазы. Чем выше это отношение, тем полнее использован кормовой субстрат. Снижение этого отношения в толстом отделе кишечника у песцов до 0,2–0,8 указывает на снижение скорости усвоения нутриентов. Высокий коэффициент ПЭФ/НОК в химусе двенадцатиперстной кишки у песцов может служить индексом «слизисто-механической защиты» и показывать активность секреции муцинов слизи для формирования структуры химуса и удаления абразивных и грубых частиц корма. В целом на протяжении тонкого и толстого кишечника это отношение составляет 0,2–0,5, являясь физиологически оптимальным для полостного пищеварения.

Распределение кальция в стенке кишечника у песцов выявило ярко выраженную сегментарную специфику. Максимальная концентрация кальция на протяжении всего кишечника песцов фиксируется в слизистой оболочке. Пик его содержания в слизистой оболочке ободочной кишки (10,58 г% в сухом веществе) указывает на трансклеточный перенос в этом отделе, где максимальна экспрессия TRPV6-каналов и кальбиндина-D9k, обеспечивающих насыщаемый витамин D-зависимый транспорт. Относительно низкие значения уровня кальция в слизистой оболочке двенадцатиперстной и тощей кишке 4,39 и 3,88 г% в сухом веществе связаны с доминированием параклеточного переноса в этих зонах, где кальций движется по концентрационному градиенту через межклеточные промежутки. Увеличение уровня кальция в слизистой подвздошной кишки до 5,47 г% в сухом веществе показывает, что параклеточная абсорбция сопряжена с образованием молекулярных комплексов части кальция с непереваримыми жирными кислотами и образованием кальциевых мыл, а также с более низкой активностью витамин D-рецепторов.

Слой слизистых наложений, как промежуточный компартмент между полостью кишки и апикальной мембраной энтероцитов, также содержит высокие концентрации кальция от 4,15 до 5,93 г% в сухом веществе. Муциновый гель адсорбирует двухвалентные катионы, создавая пристеночный резерв, доступный для последующего захвата энтероцитами. Отсутствие слоя слизистых наложений в ободочной кишке, вероятно, связано с различной архитектурой муцинового слоя, где он является рыхлым и прерывистым. В серозно-мышечном слое содержание кальция динамично возрастает с 1,92 г% в сухом веществе в двенадцатиперстной кишке до 3,78 г% в сухом веществе в подвздошной кишке. Этот уровень отражает не только функциональную насыщенность слоя из-за внутриклеточного кальция с базальным уровнем для поддержания постоянного тонуса кишечной стенки и для запуска перистальтики гладкой мускулатуры, но и создает концентрационный градиент для абсорбции элемента.

Энтеральный метаболизм кальция характеризуется динамикой роста концентрации в химусе с 16 до 22,6 г% в сухом веществе по мере его продвижения по кишечнику в проксимально-дистальном направлении (табл. 2). Анализ содержания кальция во фракциях химуса показал, что основная его часть на всём протяжении кишечника ассоциирована с непереваренным остатком корма. При этом концентрация возрастает с минимума в тощей 68 г% в сухом веществе до максимума в слепой кишке 152 г% в сухом веществе, что образует экзогенный пул на уровне энтеральной среды и обусловлено скоплением НОК в виде костных субпродуктов в дистальных отделах. Кальций, экскретированный из корма или секретированный с пищеварительными соками, частично остается в растворимом виде, что обеспечивает параклеточный механизм его абсорбции. Его концентрация в РФ химуса тонкого отдела кишечника имеет минимальные показатели 2,5–5 г% в сухом веществе, сопоставимые с уровнем в слизистой оболочке и слое слизистых наложений, и резко возрастает в толстом отделе кишечника до 21 г% в сухом веществе, что связано с высвобождением элемента из комплексов под действием бактериальных ферментов и снижением pH при образовании лактата и короткоцепочечных кислот, повышающих растворимость.

Плотная эндогенная фракция химуса кумулирует экзогенный и эндогенный кальций с динамикой увеличения концентрации по направлению к дистальным отделам с 10 до 83 г% в сухом веществе в ободочной кишке. С одной стороны, это сдерживает абсорбцию элемента и, вероятно, регулирует гомеостатическое равновесие в его метаболизме; с другой стороны, обеспечивает наличие направленного концентрационного градиента из энтеральной среды во внутреннюю среду организма, а также создает его резервное депо для последующей трансклеточной абсорбции.

4. Обсуждение

Таким образом, структурная организация химуса песцов представляет собой гетерогенную систему, в которой по мере продвижения по кишечнику происходит закономерное достоверное (p < 0,001) накопление непереваренных частиц корма до 71% в сухом веществе. При этом нативный химус содержит 70–85% воды, которая, удерживаясь мукополисахаридами, образует гидратированную полостную слизь. Также при защелачивании поступающего в кишечник желудочного содержимого образуются флокулярные гелевые структуры, иммобилизирующие значительную часть панкреатических и собственных кишечных ферментов. Секреция муцинов с пищеварительными соками, кишечная слизь, постоянно десквамируемые эпителиоциты с гликокаликсом дополняют эндогенные компоненты химуса, которые изначально составляют значительный его объем по сравнению с экзогенным пищевым субстратом. В итоге в кишечной полости образуется специфическая энтероплазма, которая факультативно фиксирует ферменты и организует сопряжение процессов полостного и пристеночного гидролиза нутриентов. Коэффициентные отношения сухого вещества фракций химуса показали, что в тонком кишечнике доминируют ферментативные процессы при максимальном коэффициенте РФ/НОК в тощей кишке, тогда как в толстом отделе эффективность переваривания падает со снижением РФ/НОК до 0,2–0,8, а слизисто-механическая защита активнее проявляется в двенадцатиперстной кишке.

Распределение кальция в стенке кишечника характеризуется сегментарностью, при этом различия между отделами и слоями стенки кишечника по его содержанию высокодостоверны (p < 0,001). Наибольший вклад в вариативность вносит слизистая оболочка ободочной кишки, которая статистически значимо отличается от всех остальных значений. Максимальная концентрация элемента зафиксирована в слизистой оболочке ободочной кишки (10,58 г% на сухое вещество), что может указывать на активный витамин D-зависимый трансклеточный транспорт в этом отделе. В тонкой кишке уровень кальция в слизистой в среднем в 2–3 раза ниже, что согласуется с преобладанием параклеточного пассивного переноса.

Распределение кальция по фракциям химуса имеет общую закономерность роста концентрации элемента по мере продвижения в дистальном направлении. Резкое и достоверное (p < 0,001) повышение концентрации растворимого кальция в толстой кишке в сочетании с высоким содержанием в ПЭФ и одновременным снижением в НОК свидетельствует о вероятно высокой микробной активности в деградации кальцийсодержащих субстратов, что усиливает потенциал для его абсорбции. Плотная эндогенная фракция, включающая кишечную слизь, слущенные клетки и бактерии, аккумулирует кальций с нарастанием концентрации к ободочной кишке и выполняет двойственную функцию: с одной стороны, она сдерживает быструю абсорбцию, с другой может служить резервным депо и поддерживать концентрационный градиент, необходимый для направленного всасывания.

Анализируя уровень кальция в полостной и пристеночной слизи, можно предположить образование хелатных комплексов, играющих определенную роль в «созревании» мукополисахаридов и дальнейшей пространственной агрегации энтероплазмы химуса при физиологической регенерации не только пристеночной, но и полостной слизи кишечника.

Являясь основной составной частью ПЭФ химуса, мукополисахариды имеют отрицательные заряды ОН⁻ и, следовательно, могут проявлять сродство к кальцию, который сам, являясь активным комплексообразователем, может образовывать хелатные соединения. Такое взаимодействие кальция с ПЭФ может иметь важное физиологическое значение, ингибируя или стимулируя абсорбцию. Также протеогликановые системы полостной слизи как полидентантные лиганды, образуя хелатные комплексы с кальцием, формируют наноупорядоченный каркас энтероплазмы, что в целом структурирует химус и способствует образованию около энтероцитов специфической коллоидной среды с громадной фрактальной поверхностью, чувствительной к различным физико-химическим факторам экзогенного и эндогенного характера.

5. Заключение

Таким образом, энтеральный метаболизм кальция у песцов не сводится лишь к трансклеточному или параклеточному переносу, а, вероятно, является многофакторным процессом, интегрирующим физико-химические свойства химуса, регенерацию муцинового геля, бактериальную активность и региональные морфо-функциональные особенности отделов кишечника. Плотная эндогенная фракция химуса кишечника благодаря сорбционным механизмам и гетероионному обмену заслуживает особого внимания как потенциальный резервуар свободных ионов кальция, участвуя в регуляции его метаболизма на уровне энтеральной и внутренней среды организма. Полученные экспериментальные данные могут служить практической основой для оптимизации рационов пушных зверей с учётом биодоступности кальция, а также открывают направление для сравнительных исследований на других представителях семейства псовых и, возможно, на животных с иным строением желудочно-кишечного тракта

The additional file for this article can be found as follows: