1. Введение

В последние десятилетия наблюдается устойчивый рост интереса к функциональным пищевым продуктам, содержащим пробиотические микроорганизмы, способные оказывать благоприятное воздействие на здоровье человека. Среди различных категорий функциональных продуктов ферментированные молочные продукты, в частности йогурт, занимают одно из ведущих мест благодаря своей традиционной распространённости и высокой технологической совместимости с пробиотическими культурами [1]. Наиболее широкое применение в составе кисломолочных продуктов получили представители рода Lactobacillus, среди которых особое место занимает Lactobacillus acidophilus — гомоферментативная молочнокислая бактерия, обладающая доказанной способностью снижать проявления лактазной недостаточности, модулировать состав кишечной микробиоты и усиливать иммунный ответ [2], [3]. Однако ключевым фактором, определяющим терапевтическую эффективность пробиотиков, является сохранение их жизнеспособности в процессе технологической обработки, хранения и последующего прохождения через желудочно-кишечный тракт. Согласно «Руководству по оценке пробиотиков в пищевых продуктах», разработанному совместной рабочей группой FAO/WHO, минимальная концентрация жизнеспособных пробиотических клеток в продукте на момент употребления должна составлять не менее 10⁶–10⁷ КОЕ/г [4].

Сохранение жизнеспособности L. acidophilus в йогурте сопряжено с рядом технологических трудностей. В процессе ферментации и последующего холодильного хранения происходит постепенное накопление органических кислот (постацидификация), что приводит к снижению pH среды и, как следствие, к уменьшению количества жизнеспособных клеток пробиотика [5]. Показано, что длительное хранение кисломолочных продуктов сопровождается дальнейшим накоплением органических кислот (постацидификацией) и увеличением синерезиса (отделения сыворотки), что негативно сказывается как на выживаемости пробиотических бактерий, так и на органолептических свойствах продукта [6].

Одним из наиболее перспективных подходов к решению проблемы сохранения жизнеспособности пробиотиков является их инкапсулирование в гидрогелевые матрицы. Среди разнообразия материалов для инкапсуляции — хитозана, пектина, желатина, каррагинана — наиболее широкое распространение получил альгинат натрия благодаря своей биосовместимости, мягким условиям гелеобразования (ионотропное сшивание ионами Ca²⁺), а также статусу GRAS (Generally Recognized as Safe) [7], [8]. Альгинатные капсулы обеспечивают физическую изоляцию пробиотических клеток от агрессивных факторов внешней среды, что позволяет повысить их выживаемость при хранении и в условиях желудочно-кишечного тракта [9]. Однако, как отмечается в современных исследованиях, использование одного лишь альгината не всегда обеспечивает достаточный уровень защиты, что стимулирует поиск подходов к модификации альгинатной матрицы путём добавления вторичных биополимеров [10].

Отдельного внимания заслуживает стратегия совместного инкапсулирования пробиотиков с пребиотическими компонентами — создание синбиотических систем, в которых пробиотик и пребиотик доставляются в организм одновременно, что потенциально может усиливать положительный эффект за счёт синергизма. В качестве пребиотического компонента всё большее внимание исследователей привлекают β-глюканы — полисахариды, состоящие из остатков D-глюкозы, соединённых β-гликозидными связями. β-глюканы присутствуют в клеточных стенках злаков, дрожжей и грибов и обладают широким спектром биоактивных свойств, включая иммуномодулирующее, гипогликемическое, противоопухолевое и, что особенно важно в контексте данной работы, пребиотическое действие [11], [12]. Исследованиями на модельных системах подтверждено, что β-глюканы грибного происхождения способны избирательно стимулировать рост молочнокислых бактерий, включая Lactobacillus acidophilus, а также повышать их метаболическую активность [13]. Кроме того, β-глюканы обладают высокой водоудерживающей способностью и могут выступать в роли структурообразователя, потенциально улучшая физико-химические свойства ферментированных молочных продуктов [14].

Несмотря на имеющиеся отдельные работы по применению β-глюканов в системах доставки пробиотиков, комплексное исследование влияния синбиотического комплекса на основе альгината, β-глюкана P. ostreatus и L. acidophilus на качественные характеристики йогурта до настоящего времени не проводилось. Остаются невыясненными вопросы о том, как внесение таких капсул сказывается на динамике кислотности, синерезисе, вязкости и органолептических свойствах готового продукта в процессе холодильного хранения.

Цель настоящей работы заключалась в оценке влияния разработанного синбиотического комплекса (альгинатные капсулы, содержащие β-глюкан Pleurotus ostreatus и Lactobacillus acidophilus) на физико-химические, реологические и органолептические свойства йогурта в процессе холодильного хранения.

2. Объект и методы исследования

Объектами исследования являлись альгинатные капсулы, содержащие β-глюкан, выделенный из плодовых тел вешенки обыкновенной (Pleurotus ostreatus), и штамм Lactobacillus acidophilus ВКПМ B-9012, а также образцы йогурта, изготовленные с добавлением данных капсул. Штамм Lactobacillus acidophilus получен из Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ, Москва). β-глюкан выделяли из высушенных плодовых тел Pleurotus ostreatus двукратной трёхчасовой экстракцией 80% этанолом с последующей двукратной трёхчасовой водной экстракцией и осаждением 96% этанолом; полученный осадок высушивали при 50°C [15].

Капсулы получали методом экструзии через иглу 25G с помощью стерильного шприца. Для получения пустых капсул 1,0%-ный раствор альгината натрия экструдировали в 2,0%-ный раствор CaCl₂. Сформированные капсулы выдерживали в растворе CaCl₂ в течение 30 мин для завершения сшивания, затем отмывали физиологическим раствором.

Оптимальный состав капсул (альгинат натрия 1,0%, β-глюкан P. ostreatus 2,0%, CaCl₂ 2,0%) был определён на основании полного факторного эксперимента по эффективности инкапсуляции, сферичности и диаметру капсул. При данных параметрах эффективность инкапсуляции составила 86,8 ± 1,9%, диаметр капсул — 1,7–1,8 мм, сферичность — 0,97–0,98.

Для получения синбиотических капсул культуру L. acidophilus выращивали в среде MRS при 37°C в течение 18 ч в анаэробных условиях, осаждали центрифугированием, дважды отмывали и ресуспендировали в физиологическом растворе до концентрации 1×10¹⁰ КОЕ/мл. Полученную суспензию клеток смешивали с 1,0%-ным раствором альгината натрия и 2,0%-ным раствором β-глюкана в соотношении 1:1:1, после чего экструдировали в 2,0%-ный раствор CaCl₂. Капли выдерживали 30 мин для сшивания, затем капсулы отмывали физиологическим раствором.

Для приготовления йогурта пастеризованное молоко (жирностью 2,5%) нагревали до 90°C (10 мин), охлаждали до 42±1°C и вносили заквасочную культуру (Streptococcus thermophilus, Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, Lactobacillus casei) в количестве 0,3%. Молоко разделяли на три партии: контроль, образец с пустыми капсулами (1,0%) и образец с синбиотическими капсулами (1,0%). Капсулы добавляли одновременно с закваской. Смеси инкубировали при 42±1°C до pH 4,5±0,1 (5,2 ч), затем охлаждали до 4±2°C и хранили 14 суток для последующего анализа физико-химических и реологических показателей. Отбор проб проводили на 1, 3, 7 и 14-е сутки.

Титруемую кислотность определяли по ГОСТ 31981-2013 титрованием 0,1 н. раствором NaOH (результат в °T). Активную кислотность (pH) измеряли потенциометрическим методом по ГОСТ 32892-2014 с помощью калиброванного pH-метра. Синерезис (отделение сыворотки) определяли гравиметрическим методом: 10 г йогурта центрифугировали при 3000 g в течение 15 мин при 10°C, отделяли надосадочную жидкость и взвешивали осадок; синерезис рассчитывали как отношение разницы между начальной массой образца и массой осадка к начальной массе образца, выраженное в процентах.

Кажущуюся вязкость измеряли по ГОСТ 33768-2015 с помощью ротационного вискозиметра с коаксиальной цилиндрической измерительной системой (ротор H1) при температуре 4±2°C и скорости сдвига 10 с⁻¹, выдерживая каждый образец в состоянии покоя 5 мин перед измерением для восстановления структуры.

Концентрацию жизнеспособных клеток L. acidophilus в йогурте с синбиотическими капсулами определяли на 1, 3, 7 и 14-е сутки холодильного хранения при 4±2°C. Для этого из йогурта отбирали 0,1 г капсул, трижды промывали стерильным физиологическим раствором (0,9% NaCl) для удаления остатков молочной матрицы. Капсулы переносили в 10 мл 0,05 М раствора цитрата натрия (pH 7,0) и инкубировали при перемешивании (150 об/мин) в течение 15 мин до полного растворения альгинатной матрицы. Полученную суспензию клеток центрифугировали (3000 g, 10 мин), надосадочную жидкость удаляли, осадок дважды отмывали стерильным физиологическим раствором (0,9% NaCl) и ресуспендировали в 10 мл того же раствора. Затем готовили серийные десятикратные разведения в стерильном физиологическом растворе. Из каждого разведения высевали по 0,1 мл на поверхность селективной среды MRS-агар с добавлением 0,15% жёлчных кислот (MRS-bile agar), подавляющей рост заквасочных микроорганизмов. Чашки инкубировали в анаэробных условиях при 37±1°C в течение 48–72 ч. Концентрацию жизнеспособных клеток выражали в КОЕ/г йогурта с учётом массовой доли капсул (1%)

Органолептическую оценку проводили в соответствии с ГОСТ 31986-2012. Дегустационная комиссия состояла из 12 обученных специалистов (сотрудников и аспирантов кафедры микробиологического синтеза Санкт-Петербургского государственного технологического института), каждый из которых имел опыт в сенсорном анализе ферментированных молочных продуктов. Оценку осуществляли на 1-е сутки хранения после приготовления йогурта. Образцы подавали в закодированном виде при температуре 4±2°C в случайном порядке. Дегустаторы оценивали семь показателей по 5-балльной шкале: внешний вид, цвет, запах, вкус, консистенцию, послевкусие и ощущение во рту. Результаты физико-химических и реологических измерений представлены в виде среднего значения ± стандартное отклонение.

3. Результаты и обсуждение

В ходе экспериментальной работы были исследованы физико-химические, реологические и органолептические свойства трёх групп образцов йогурта: контрольного (без добавления капсул), с пустыми альгинатными капсулами и с синбиотическими капсулами, содержащими β-глюкан Pleurotus ostreatus и Lactobacillus acidophilus. Оценку проводили в процессе холодильного хранения при 4±2°C на 1, 3, 7 и 14-е сутки. В процессе хранения всех образцов наблюдалось закономерное увеличение титруемой кислотности (Рисунок 1) и снижение pH, что обусловлено постацидификацией — продолжением метаболической активности заквасочной микрофлоры при низких температурах. Однако динамика этих изменений заметно различалась между образцами. Образец с синбиотическими капсулами демонстрировал наиболее медленное накопление кислоты: на 14-е сутки его титруемая кислотность была ниже, чем в контрольном образце, а pH — выше (Таблица 1). Аналогичные результаты были получены другими исследователями: показано, что добавление пробиотических культур, в том числе инкапсулированных, замедляет постацидификацию в йогурте [16], [17]. Это может быть связано с ограничением диффузии метаболитов и частичным снижением доступности субстрата для клеток внутри альгинатной матрицы, а также с изменением водоудерживающей способности системы при внесении β-глюкана. Образец с пустыми капсулами занимал промежуточное положение, что свидетельствует о некотором стабилизирующем влиянии самой альгинатной матрицы на кислотность продукта.

Одной из наиболее распространённых проблем при хранении йогурта является отделение сыворотки (синерезис), которое ухудшает как потребительские свойства продукта, так и выживаемость пробиотических культур [18]. В настоящем исследовании синерезис увеличивался во всех образцах в процессе хранения, однако в образце с синбиотическими капсулами этот процесс был значительно замедлен. На 14-е сутки синерезис в данном образце оказался почти в два раза ниже, чем в контроле (Таблица 1). Образец с пустыми капсулами также показал более низкий синерезис по сравнению с контролем, но уступал синбиотическому. Полученные результаты согласуются с данными других научных групп. Учёными из Ирака [19] было установлено, что добавление овсяного β-глюкана в йогурт из овечьего молока с пониженным содержанием жира приводит к снижению синерезиса, причём выраженность этого эффекта возрастает с увеличением концентрации полисахарида. Исследователями из Ирана [20] также показано, что внесение различных пребиотиков, включая β-глюкан, в пробиотический йогурт способствует значительному уменьшению синерезиса по сравнению с контрольным образцом. В нашей работе синерезис снизился с 24,0% в контроле до 12,9% в образце с синбиотическими капсулами, то есть в 1,9 раза. Более выраженный эффект, достигнутый в нашем исследовании по сравнению с литературными данными, может быть объяснён комбинированным действием двух факторов: альгинатные капсулы сами по себе связывают свободную влагу, а β-глюкан, диффундирующий из капсул в молочную матрицу, формирует дополнительную полисахаридную сеть, механически препятствующую отделению сыворотки.

Наибольшие значения кажущейся вязкости на протяжении всего срока хранения демонстрировал образец с синбиотическими капсулами, превышая контрольный образец на 23,6% на 14-е сутки. Образец с пустыми капсулами также имел более высокую вязкость по сравнению с контролем, что объясняется присутствием в продукте гидрогелевых частиц, увеличивающих общую вязкость системы. Полученные данные согласуются с результатами польских исследователей [21], которые показали, что добавление склероглюкана (микробного β-глюкана) в йогурт с пониженным содержанием жира повышает кажущуюся вязкость, предел текучести и твёрдость продукта, а также полностью устраняет синерезис. Таким образом, достигнутое нами увеличение вязкости на 23,6% подтверждает структурообразующую роль β-глюкана в кисломолочных продуктах. Этот эффект может быть обусловлен синергическим действием β-глюкана и альгинатной матрицы капсул. Кроме того, инкапсулирование пробиотика замедляет его метаболическую активность, что способствует более медленному снижению вязкости в процессе хранения. Следует также отметить, что более высокие значения pH в образце с синбиотическими капсулами создают благоприятные условия для упорядоченной агрегации казеиновых мицелл без избыточного сокращения белковой сети, что дополнительно стабилизирует структуру продукта.

Исходная концентрация инкапсулированных клеток в свежеприготовленных капсулах (1 день) составляла 8,9×10⁷ КОЕ/г (7,95 log). После 14 суток холодильного хранения количество жизнеспособных клеток снизилось до 2,6×10⁷ КОЕ/г (7,41 log). Снижение титра за 14 дней составило 0,54 log, сохранность — 29,2% (Рисунок 2).

Конечная концентрация пробиотика (2,6×10⁷ КОЕ/г) превышает терапевтический минимум FAO/WHO (10⁶–10⁷ КОЕ/г). Полученные результаты согласуются с литературными данными: в работе [22] снижение титра инкапсулированного L. acidophilus составило 0,6–0,8 log за 21 день, а конечные титры находились в диапазоне 7,6–7,8 log, что сопоставимо с нашими показателями.

Таким образом, разработанная альгинатная матрица с включением β-глюкана обеспечивает стабильную сохранность пробиотика в процессе хранения, а конечный титр гарантирует пробиотическую эффективность продукта в течение всего срока годности.

Органолептический анализ, проведённый на 1-е сутки хранения, показал, что образец с синбиотическими капсулами получил наиболее высокие оценки по большинству показателей, особенно по вкусу, послевкусию и общей приемлемости (Рисунок 3). Внешний вид образцов йогурта на 1-й день хранения представлен на рисунке 4. Дегустаторы отмечали, что вкус этого образца был более мягким и сбалансированным, без излишней кислотности, а наличие капсул воспринималось как оригинальный текстурный элемент, не ухудшающий консистенцию. Контрольный образец характеризовался более интенсивным кисломолочным запахом, который часть дегустаторов оценила как излишне резкий. Образец с пустыми капсулами получил оценки, близкие к контрольному, но с некоторым снижением за счёт менее выраженного вкуса и аромата. По результатам дегустационной оценки 58% дегустаторов отдали предпочтение образцу с синбиотическими капсулами, что подтверждает его высокие потребительские свойства

4. Заключение

Разработанный синбиотический комплекс на основе альгината, β-глюкана Pleurotus ostreatus и Lactobacillus acidophilus оказывает многофакторное положительное влияние на качество йогурта. Полученные результаты свидетельствуют о том, что разработанный синбиотический комплекс улучшает структурно-механические свойства йогурта (повышение вязкости на 23,6%, снижение синерезиса в 1,9 раза), замедляет постацидификацию (титруемая кислотность на 14-е сутки на 14,1 °Т ниже контроля, pH — на 0,14 выше), что открывает перспективы для создания функциональных кисломолочных продуктов с улучшенными потребительскими свойствами.

Замедление постацидификации и снижение синерезиса, наблюдаемые в образце с синбиотическими капсулами, согласуются с известными данными о том, что β-глюканы обладают высокой водоудерживающей способностью и способны стабилизировать белковую матрицу кисломолочных продуктов. Повышение вязкости может быть связано как с присутствием самих капсул, так и с диффузией β-глюкана в молочную среду, где он действует как дополнительный загуститель.

Разработанная синбиотическая система на основе альгинатной матрицы с включением β-глюкана P. ostreatus и L. acidophilus обеспечивает сохранность пробиотика в процессе хранения: титр снизился с 8,9×10⁷ до 2,6×10⁷ КОЕ/г за 14 суток (снижение на 0,54 log). Конечная концентрация пробиотика превышает терапевтический минимум FAO/WHO. Полученные результаты находятся в диапазоне значений, характерных для инкапсулированных пробиотических систем, а технологическая простота может рассматриваться как преимущество для потенциального промышленного применения.

Высокие органолептические оценки подтверждают, что присутствие капсул не ухудшает, а в отдельных аспектах улучшает потребительские свойства продукта. Полученные результаты свидетельствуют о перспективности использования разработанных синбиотических капсул для создания функциональных кисломолочных продуктов с улучшенными физико-химическими, структурно-механическими и органолептическими свойствами.

The additional file for this article can be found as follows: