1. Введение

Хроническая венозная недостаточность нижних конечностей часто приводит к образованию трофических язв, которые являются ее наиболее частым осложнением. Эти язвы затрагивают примерно 2% трудоспособного населения в индустриально развитых странах, а у пожилых людей их распространенность увеличивается до 4–5% [1]. Важнейшими участниками процесса заживления ран являются макрофаги. Они выполняют функцию «уборщиков», удаляя из раны погибшие клетки и патогены. Кроме того, макрофаги стимулируют фибробласты, выделяя факторы роста, компоненты системы комплемента и интерферон, но при этом могут и подавлять их активность, высвобождая воспалительные медиаторы и протеазы [2], [3]. В последние десятилетия гиалуроновая кислота (ГК) все чаще используется в качестве биоматериала как в клинических, так и в исследовательских целях [4]. ГК демонстрируют двойственный характер своего воздействия. Высокомолекулярные формы ГК проявляют противовоспалительную и репаративную активность, что сопряжено с иммуносупрессией. В то же время низкомолекулярные фракции, взаимодействуя с паттернраспознающими рецепторами, инициируют сигнальные каскады, ведущие к синтезу провоспалительных медиаторов, тем самым оказывая стимулирующее действие [5]. В этой связи низкомолекулярная гиалуроновая кислота является привлекательным полимером для использования в исследованиях тканевой инженерии, поскольку его биодеградация и биосовместимость поддерживают рост и пролиферацию клеток [6].

Научные публикации, раскрывающие содержание и функциональную роль макрофагов в патогенезе репарации ишемизированных кожных дефектов при стимуляции регенеративного потенциала посредством клеточных технологий, представлены в недостаточном объеме. Адекватная оценка регенеративного гистогенеза и динамики популяций макрофагов на различных этапах регенеративного гистогенеза после трансплантации низкомолекулярной гиалуроновой кислоты в сочетании с дермальными фибробластами возможна исключительно посредством экспериментального подхода с использованием модельных ран у лабораторных животных [7].

Настоящее исследование направлено на количественную оценку инфильтрации макрофагов в ткани регенерирующей модельной кожной раны, подвергшейся ишемии, после применения комбинации низкомолекулярной гиалуроновой кислоты и аллогенных дермальных фибробластов.

2. Методы и принципы исследования

Исследование выполнено на 40 белых половозрелых мышах линии С57/В1 в возрасте 5–7 месяцев, которые содержались в стандартных условиях вивария Ордена Трудового Красного Знамени медицинского института имени С.И. Георгиевского (структурное подразделение) ФГАОУ ВО «Крымский федеральный университет имени В.И. Вернадского». Все манипуляции с животными проводились в соответствии с международными и национальными стандартами, а именно: Европейской конвенцией о защите позвоночных животных (ETS №123, 1986 г.), Правилами лабораторной практики и приказом Минздрава России № 199н от 01.04.2016 г. Для проведения эксперимента мыши были разделены на две группы: контрольную и экспериментальную, каждая из которых насчитывала по 20 особей (см. табл. 1). Ишемизированная кожная рана была смоделирована хирургическим путем на спине мышей обеих групп, в межлопаточной области [8]. Перед проведением операции животным внутрибрюшинно вводили 0,3–0,4 мл 2,5% раствора авертина.

В рамках данного исследования, для животных экспериментальной группы, дермальные аллофибробласты были выделены из образцов кожи с использованием ферментативного метода. Последующее культивирование проводилось в питательной среде DMEM/F12 (Lonza) [9]. Для терапевтического вмешательства в ишемизированные кожные раны у мышей данной группы использовались аллогенные дермальные фибробласты, характеризующиеся экспрессией следующих поверхностных маркеров: CD44+, CD90+, CD105±, CD73±, CD45+, а также отсутствием экспрессии CD31-, CD34- и CD45-.

Мышам экспериментальной группы интраоперационно в дно и вокруг раны вводили стабилизированную низкомолекулярную гиалуроновую кислоту биосинтетического происхождения "Fillervit B", производитель: Южная Корея в сочетании с 1,33 млн клеток аллогенных фибробластов 3 пассажа с фенотипом CD44+CD90+CD105+CD73±CD45+CD31-CD34-CD45- в ростовой среде DMEM/F12. Смесь вводили тоннельным способом с помощью игл 30G, 13мм. Послеоперационное ведение ран в обеих группах включало наложение асептической повязки «Воскопран» с левомиколем, фиксированной к силиконовому кольцу.

На 4-й, 10-й, 12-й, 19-й и 26-й дни послеоперационного периода осуществлялось интраоперационное иссечение регенерата. Полученные образцы подвергались фиксации в 10% забуференном растворе формалина. Для гистологического анализа материал заливали в парафин и окрашивали гематоксилином и эозином (H&E) с целью визуализации морфологических изменений в процессе заживления модельной раны. Исследование гистологических препаратов проводилось с помощью светооптического микроскопа OLIMPUS SX-31. Процедура подготовки включала фиксацию биоптатов в 10% нейтральном формалине, последующую заливку в парафин и приготовление срезов толщиной 7 мкм с использованием микротома. Окрашивание срезов выполнялось гематоксилином Майера и эозином.

Идентификация макрофагов осуществлялась посредством иммуногистохимического анализа, в ходе которого определялось присутствие в клетках специфического антигена CD68. В качестве первичных антител использовались антитела CD68 от американской компании Gene Tex Inc, разведенные в соотношении 1:100. Далее, на подготовленные срезы наносились вторичные антитела, связанные с ферментом пероксидазой хрена, и проводилась инкубация во влажной камере в течение 30 минут. Для визуализации участков, где произошло взаимодействие антител с антигенами, применялся хромоген 3,3-диаминобензидина (DAB Substrate Chromogen) производства Gene Tex Inc (США), наносимый в количестве 1–3 капель на каждый срез. Для обеспечения четкости изображения клеточных структур и ядер, срезы дополнительно окрашивались гематоксилином Майера в течение 3 минут. Для гарантии достоверности полученных данных и исключения возможных артефактов (ложноположительных или ложноотрицательных результатов) было проведено соответствующее контрольное исследование.

Определение индекса макрофагов включало микроскопическое исследование биоптатов с увеличением ×1350. Подсчитывали число CD68-позитивных клеток на 100 клеток, а затем рассчитывали их процентное соотношение, усредненное по всем срезам в каждой группе (контрольной и экспериментальной). Для проверки соответствия данных нормальному распределению использовали критерий Шапиро–Уилка [10]. Сравнение между контрольной и опытной группами мышей проводилось попарно. Поскольку данные не имели нормального распределения, для статистического сравнения применяли непараметрический критерий Манна–Уитни. Описательная статистика включала медиану и интерквартильный размах (первый и третий квартили) [11]. Все статистические вычисления проводились в программной среде R (версия 4.2.3) [10], а результаты визуализировались с использованием пакета "Ggplot2" [12]. Уровень статистической значимости был установлен на уровне P <0,05.

3. Основные результаты

Через четыре дня после хирургического создания ишемизированной раны, гистологический анализ биоптатов показал высокую концентрацию CD68-позитивных макрофагов в тканях обеих групп. Это количество оказалось максимальным за весь период заживления ишемизированного кожного дефекта. Важно отметить, что применение низкомолекулярной гиалуроновой кислоты в сочетании с аллофибробластами привело к статистически значимому уменьшению среднего числа макрофагов на 15,41% (p<0,01) по сравнению с контрольной группой (данные представлены в таблице 2). Локализация CD68-положительных клеток в непосредственной близости от кровеносных капилляров свидетельствует об их проникновении из кровеносного русла. Также было замечено, что струп, образовавшийся на ране, был густо пропитан погибшими макрофагами.

Через 10 дней после начала регенерации, эпителиальное покрытие биоптатов демонстрирует различия между группами. В центре биоптатов эпителий располагается в один ряд, а по периферии — в несколько рядов, причем в экспериментальной группе этот многослойный эпителий более развит. Грануляционная ткань в обеих группах находится на второй стадии пролиферации, характеризующейся формированием коллагеновой сети и наличием фибробластов. CD68-положительные клетки, являющиеся маркерами макрофагов, обнаруживаются в обеих группах. За период с 4-х до 10-х суток наблюдалось статистически значимое снижение количества этих клеток в обеих группах, причем в экспериментальной группе снижение было более существенным. Тем не менее, на 10-е сутки, медианное значение индекса макрофагов в контрольной группе было статистически значимо выше (на 32,58%) по сравнению с экспериментальной.

Через 12 дней после возникновения ишемизированной раны, в обеих группах было зафиксировано утолщение эпидермиса. Однако, динамика содержания макрофагов оказалась различной: в контрольной группе их количество статистически значимо снизилось на 20,56±0,01% (p<0,01), тогда как в экспериментальной группе наблюдалось статистически значимое увеличение на 12,10±0,01% (p<0,01).

К 19-му дню, несмотря на разнонаправленные процессы, статистически значимых различий в среднем количестве макрофагов между контрольной и экспериментальной группами не выявлено (см. табл. 2). По сравнению с показателями 12-го дня, в контрольной группе произошло существенное снижение макрофагов на 45,17±0,01% (p<0,01), а в экспериментальной — на 34,05±0,01% (p<0,01).

На 26-е сутки продолжился процесс снижения присутствия макрофагов в обеих изученных группах. Числовое выражение медианного значения индекса макрофагов достоверно снизилось в контрольной группе на 26,29±0,01% (p<0,01) и в экспериментальной группе — на 72,38±0,01% (p<0,01). В результате в глубоких слоях сформированного рубца остались единичные CD68-положительные клетки, которых в контрольной группе на 56,49±0,01% (p<0,01) достоверно больше, чем в экспериментальной группе (см. табл. 2).

4. Обсуждение

На первой стадии раневого процесса стадии воспаления и очищения раны от некротизированных компонентов именно макрофаги выполняют функцию подавления воспалительной реакции, элиминации патогенов и удаления клеточного детрита и продуктов деградации внеклеточных белков [13], ускоряя тем самым репаративные процессы [14], [15]. Анализ динамики регенерации ишемизированной кожной раны показал, что на 4-е сутки гистогенеза медианное значение индекса макрофагов в контрольной и экспериментальной группах демонстрирует наивысшие числовые показатели за весь исследуемый период. Применение низкомолекулярной гиалуроновой кислоты в комбинации с дермальными аллофибробластами привело к достоверному снижению данного параметра, что обусловлено противовоспалительными свойствами обоих введенных компонентов [4]. Параллельно с процессом заживления кожного дефекта, наблюдалось последовательное уменьшение присутствия макрофагов в обеих группах, причем наиболее выраженное снижение отмечалось в экспериментальной группе, где сформировался дефинитивный регенерат без признаков остаточного воспаления. Дополнительно, на 12-е сутки регенеративного гистогенеза в экспериментальной группе было зафиксировано увеличение количества макрофагов по сравнению с 10-ми сутками. Это явление связывают с регулирующей функцией макрофагов в отношении избыточной синтетической активности, включая активность трансплантированных аллофибробластов [16].

5. Заключение

После трансплантации низкомолекулярной гиалуроновой кислоты с дермальными аллофибробластами воспалительный процесс в биоптатах регенерирующей ишемизированной раны кожи активно снижен по сравнению с контрольной группой крыс, не получавших такого лечения, за счет противовоспалительного действия низкомолекулярной гиалуроновой кислоты, а также ее подавляющего влияния на выделение провоспалительных цитокинов дермальными фибробластами. Одновременно с этим привлеченные воспалительным процессом макрофаги подавляют усиленный синтез коллагеновых волокон дермальными фибробластами, что приводит к формированию нормотрофического рубца близкого по строению к неповрежденной коже. Исследования процессов регенерации кожи после применения клеточных технологий вносит вклад в понимание процессов регенеративного гистогенеза через оценку присутствия основных клеток и межклеточного вещества соединительной ткани дермы: фибробластов и макрофагов, а также низкомолекулярной гиалуроновой кислоты.

The additional file for this article can be found as follows: