1. Введение

Оптические или лазерные твизеры, также известные как оптические ловушки (лазерный пучок с градиентной мощностью), образуются генерацией сил порядка 10-12Missing Mark : sup Н в малой области при взаимодействии сфокусированных лазерных пучков с диэлектрическими частицами, содержащимися в живых клетках и органеллах. Луч света можно рассматривать как поток частиц, обладающий некоторой кинетической энергией, которая передается частицам вещества, ускоряя их. Если подобрать такой световой пучок, что оказываемое давление света было направлено противоположно силам гравитации, то частицы перейдут в состояние невесомости. С появлением лазеров, излучение может использоваться для микроманипуляций с живыми клетками в качестве оптических или лазерных пинцетов

[1]

Фокусируя лазерный пучок объективом с высокой числовой апертурой, создается градиентное поле интенсивности света с наибольшими значениями интенсивности в фокальном объеме, уменьшающееся к периферии. Взаимодействие с объектами, обладающими большими показателями преломления, чем окружающая среда, формирует градиентные силы. Если взаимодействие обуславливается в основном преломлением, а поглощение света незначительно, то возникают силы по направлению к фокальному объему. Возникающие силы порядка 10-12Missing Mark : sup Н (оптическая ловушка) могут использоваться, чтобы тянуть и удерживать микро- и нано-метровые объекты в фокальном объеме (рис. 1).

Типичными источниками для оптической ловушки является Nd:YAG или диодные лазеры с длиной волны 1064 нм. Часто лазерный луч направляется с помощью световодов непосредственно в видео-микроскоп и фокусируется в дифракционноограниченную точку объективами с числовой апертурой больше единицы

[2]

Несмотря на широкое применение лазерных твизеров в клеточной биологии для сортировки, спектроскопии комбинационного рассеяния, изучения осмотического шока и межклеточных взаимодействий, проблема термического воздействия на живые клетки остается недостаточно изученной. Поглощение лазерного излучения образцом может приводить к локальному перегреву и повреждению биологических структур, что особенно критично для длительных экспериментов. Известно, что излучение ближнего ИК-диапазона (790–1064 нм) способно вызывать тепловые эффекты в клетках, при этом степень нагрева зависит от длины волны, мощности и оптических свойств образца

[11][12][13][22]

Повышение температуры оказывает комплексное влияние на клеточные структуры и функции. В первую очередь изменяются механические свойства мембраны: увеличивается текучесть липидного бислоя, что может приводить к деформациям и даже нарушению целостности мембраны при значительном нагреве. Температурные изменения также затрагивают белки, включая гемоглобин в эритроцитах, вызывая их конформационные перестройки и частичную денатурацию, что может снижать функциональную активность. Кроме того, повышенная температура влияет на ионный транспорт через мембрану, в частности увеличивает проницаемость для Ca²⁺, что может приводить к изменениям межклеточных взаимодействий и адгезии. Усиление теплового движения ускоряет биохимические реакции, однако при перегреве происходит инактивация ферментов и нарушение метаболических процессов. В совокупности эти эффекты могут вызывать изменение формы эритроцитов, нарушение их деформируемости и, в предельных случаях, гемолиз.

Однако для красных кровяных клеток (эритроцитов) количественные данные о динамике температурных полей и их зависимости от коэффициента поглощения гемоглобина практически отсутствуют, что обуславливает актуальность полученных результатов.

Целью настоящей работы является численное моделирование тепловых процессов в эритроците при облучении инфракрасным лазерным твизером (λ = 1064 нм) для оценки степени нагрева клетки и выявления роли коэффициента поглощения гемоглобина.

Задачи исследования:

- Разработать двумерную осесимметричную модель теплопереноса в системе «эритроцит — водная среда» с учетом объемного источника тепла, полученного методом Монте-Карло.

- Провести расчеты установившихся температурных полей и кинетики нагрева при различных значениях коэффициента поглощения гемоглобина

- Сопоставить результаты моделирования с известными экспериментальными данными и определить критические параметры, влияющие на тепловую нагрузку.

2. Нано- и микроманипуляции клетками

Оптические твизеры (ОТ) могут использоваться для удержания клеток в неподвижной или движущейся среде. Наиболее популярным использованием твизеров в клеточной биологии является отслеживание изменения объема клетки под воздействием осмотического шока и феноменологический анализ транспорта жидкости через клетку. Водная проницаемость, внутреннее осмотическое давление и механизмы регуляции объема клетки были изучены при помощи видео-микроскопов и цифровой обработки изображений.

Если отдельная клетка захватывается ОТ, то световой поток на поверхности клетки изменяет интенсивность и направление отраженного потока фотонов. Интенсивность рассеянного света различными клетками, в том числе лимфоцитами и гранулоцитами была записана с углами от 0.50Missing Mark : sup до 179.50Missing Mark : sup с 30 миллисекундным разрешением, и были определены действительная и комплексная временная зависимость

[3]

Спектроскопия комбинационного рассеяния также может дать необходимую информацию о внутренней структуре клетки, захваченной с помощью оптической ловушки. Эта технология была использована для биологических клеток и в дальнейшем использовалась для идентификации и выделения 6 новых видов бактерий на разной степени развития

[4][5][6]

Комбинируя спектроскопию комбинационного рассеяния с оптическими твизерами, могут быть выделены и отслежены в реальном времени циклы оксигенации красных кровяных клеток, захваченных твизером во время движения клетки в жидкости через систему микроканалов. Эта техника имеет определенный потенциал для отслеживания

Оптические твизеры позволяют перемещать клетки в жидкой среде без непосредственного физического контакта. Эта уникальная особенность очень полезна при манипуляциях с клетками в стерильных условиях. Оптические твизеры могут использоваться для формирования групп нейронов

[7]

Вакамото

[8][9][10]

Поглощение лазерного излучения образцом может привести к повреждению, так как ОТ представляет собой сильно сфокусированный луч с интенсивностью порядка нескольких МВт/см2Missing Mark : sup. Для биологических клеток очень важным фактором является используемая длина волны лазерного излучения. Было обнаружено, что практически весь спектр ближнего ИК диапазона (790–1064 нм) вызывает повреждения биологических объектов при использовании ОТ. Минимальные повреждения оказывает излучение при длине 830 и 970 нм, в то время как излучение на длине волны 870 нм и 930 нм наносит максимальный ущерб для клеток

Более короткие волны (меньше 800 нм) могут также нанести серьезные повреждения

[11][12]

Как показывают исследования, для снижения фоторазрушающего эффекта на клетки рекомендуется использовать оптические твизеры на основе Nd:YAG (1064 нм), Nd:YLF или титан-сапфирового лазера.

3. Модель расчета тепловых полей

Инфракрасные (ИК) лазерные твизеры в основном используются как диагностический инструмент в сканирующих микроскопах, а в случае ближней ИК области, как оптическая ловушка для манипуляций с живыми клетками. Типичная интенсивность в центре пучка и плотность потока фотонов, соответственно, порядка нескольких МВт/см2Missing Mark : sup или 1027Missing Mark : sup см-2Missing Mark : supс-1Missing Mark : sup

[13]

В данной работе исследовалось воздействие ИК лазерного твизера (λ=1064 нм) на красную кровяную клетку — эритроцит. При моделировании мы исходили из предположения сферической формы клетки. Хотя

Для простоты исследования клетка взвешена в воде и представляет собой однородную сферу диаметром 7 мкм, полностью состоящую из гемоглобина. Мембрана клетки не учитывалась в моделировании ввиду ее очень малой толщины, порядка 10 нм. На клетку действует сфокусированный лазерный пучок диаметром 1 мкм, мощностью 100 мВт.

При описании воздействия лазерного излучения на биологические объекты подразумевается, что оно проходит в два этапа: рассчитывается плотность поглощенной лучистой энергии в клетке, затем вычисляется количество выделившегося тепла и решается задача теплопереноса внутри среды. Для первой подзадачи применяется метод Монте-Карло, который на основе заданных правил для движения фотонов дает представление о распределении поглощенной мощности. Вторая задача решается численно, методом конечных элементов на основе уравнения теплопереноса

[14][15][16][17]

Фазовая функция [LATEX_FORMULA]p(\bar{s}, \bar{s}')[/LATEX_FORMULA] описывает рассеивающие свойства среды и представляет собой функцию плотности вероятности для рассеяния в направлении [LATEX_FORMULA]\bar{s}'[/LATEX_FORMULA] фотона, движущегося в направлении [LATEX_FORMULA]\bar{s}[/LATEX_FORMULA], т.е. характеризует элементарный акт рассеяния. Если рассеяние симметрично относительно направления падающей волны, то фазовая функция зависит только от угла рассеяния θ между направлениями [LATEX_FORMULA]\bar{s}[/LATEX_FORMULA] и [LATEX_FORMULA]\bar{s}'[/LATEX_FORMULA], т.е. [LATEX_FORMULA]p(\bar{s}, \bar{s}') = p(\theta)[/LATEX_FORMULA].

Если предположить, что рассеиватели в среде распределены случайно (отсутствие в структуре биоткани пространственной корреляции), то это приводит к следующей нормировке:

Фактор анизотропии рассеяния излучения в среде определяется как средний косинус угла рассеяния:

Значение

Измеренную фазовую функцию рассеяния удобно аппроксимировать какой-либо простой аналитической формулой. Выбор аппроксимации функции рассеяния определяется соображениями адекватности и математической простоты. В данном исследовании используется однопараметрическая функция Хени– Гринштейна

[14][15]

Метод Монте-Карло моделирует «случайный ход» пакетов фотонов в среде, обладающей поглощением и рассеиванием. На основе формул (2, 3) определяются правила рассеивания фотонов в среде

[4]

При инициировании пакета фотонов ему присваивается статистический вес

Для получения представления о распределении света в эритроците использовались данные о распределении

В табл. 1 представлены основные параметры, необходимые для решения поставленных задач, где k — коэффициент теплопроводности; с — теплоемкость; r — плотность; μaMissing Mark : sub — коэффициент поглощения; μsMissing Mark : sub — коэффициент рассеивания; n — показатель преломления, g – параметр анизотропии. Однозначное значение коэффициента поглощения μa Missing Mark : subбез помощи эксперимента установить не удалось, поэтому в данной работе рассматривается два наиболее вероятных с нашей точки зрения значения, выбранные из литературных источников

[18][19][20]

В общем случае моделирование нестационарных тепловых процессов в среде требует решения уравнения (5):

с граничными условиями, описывающими взаимодействие клетки с окружающей средой, где

Следует отметить, что ввиду малых размеров расчетной области (единицы микрометров) и относительно небольшого перепада температур (ΔT < 15°C), вкладом свободной конвекции в окружающей воде можно пренебречь. Оценка числа Рэлея (Ra) для характерного размера 10 мкм дает значение Ra ≈ 10⁻⁵, что на несколько порядков ниже критического порога возникновения конвективной неустойчивости (Ra_cr ≈ 1700). Таким образом, перенос тепла от клетки осуществляется исключительно за счет молекулярной теплопроводности, что описывается граничными условиями [7].

Поскольку обычно лазерные пучки симметричны относительно своей оси, а клетка представляет собой сферу, то задачу можно свести к двумерной и может быть выбрана цилиндрическая система координат (r,z). Помимо расчета распределения тепловых нагрузок, принципиальную роль при построении модели гипертермии клетки эритроцита играет обоснованный выбор граничных условий.

Для большей достоверности вычислений выбран достаточно большой объем в котором помещен эритроцит, линейные размеры среды много больше размеров самой клетки. На границе расчетной области задается граничное условие 1-го рода, с постоянной температурой 20 0Missing Mark : supС, что позволяет минимизировать вклад граничных условий на результаты вычислений.

На границе раздела вода/гемоглобин задается непрерывность градиента температур:

где

Для решения уравнения в динамике необходимы начальные условия. По условиям проводимых экспериментов начальная температура — комнатная температура, предположительно 20 0Missing Mark : supС.

4. Результаты и обсуждение

На рис. 2 представлены результаты моделирования распределения поглощенной мощности в эритроците и окружающей воде. Предполагается, что фокальной области также находится некоторое количество окружающей воды. Моделирование проводилось в два этапа, для разных коэффициентов поглощения гемоглобина (см. табл. 1).

[2][13]

На рис. 4 представлена динамика температуры в центре клетки эритроцита. Видно, что процесс теплопереноса устанавливается в течение 1 секунды. Полученные значения нагрева до T=27–33 °C хорошо коррелируют с известными экспериментальными данными по оптическим ловушкам. В частности, в работе [21] клеток яичника китайского хомячка (CHO) в аналогичных условиях (1064 нм, 100 мВт) зафиксирован нагрев на 1.15 ± 0.25 °C на 100 мВт. Наши расчеты для μa=0.05 см⁻¹ дают прирост около 0.7 °C/100 мВт, что укладывается в диапазон погрешностей, учитывая различие в объеме и составе клеток. Более высокое значение нагрева для μa=0.09 см⁻¹ соответствует сценарию пониженной оксигенации клетки.

Большое количество поглощенной энергии приводит к быстрому нагреву клетки, однако, выделяемое тепло быстро отводится в окружающую среду. Результаты моделирования показывают насколько важно знание точного значения коэффициента поглощения для биологических объектов. Так, при значении μaMissing Mark : sub=0.05 см-1Missing Mark : sup температура клетки возрастает лишь до 27 0Missing Mark : supС, а при μaMissing Mark : sub=0.09 см-1Missing Mark : sup температура уже составляет 33 0Missing Mark : supС. Учитывая этот факт, полученные результаты все же укалываются в известные значения температуры для живых клеток

[13][14]

А. Установлено, что стационарная температура в центре эритроцита существенно зависит от коэффициента поглощения: при μₐ = 0,05 см⁻¹ температура достигает 27 °C (нагрев на 7 °C), тогда как при μₐ = 0,09 см⁻¹ — 33 °C (нагрев на 13 °C).

Б. Показано, что характерное время установления теплового равновесия составляет порядка 1 с, что указывает на быстрый выход системы на стационарный режим.

В. Выявлена количественная согласованность модели с экспериментальными данными: для μₐ = 0,05 см⁻¹ температурный отклик (~0,7 °C на 100 мВт) сопоставим с результатами для клеток CHO (1,15 ± 0,25 °C/100 мВт) при аналогичных условиях. Более высокий нагрев при μₐ = 0,09 см⁻¹ соответствует сценарию пониженной оксигенации эритроцита.

Впервые проведено количественное численное исследование температурных полей в эритроците при воздействии ИК-лазерного твизера (λ = 1064 нм) на основе связанной модели «оптическое поглощение + теплоперенос».

Показано, что коэффициент поглощения гемоглобина является ключевым параметром, определяющим тепловой отклик клетки: увеличение μₐ с 0,05 до 0,09 см⁻¹ приводит к росту стационарной температуры на ~6 °C.

Установлено, что, несмотря на локализацию поглощения энергии вблизи границы клетки, формируется квазиизотропное температурное поле вследствие эффективного теплоотвода в окружающую среду.

Полученные результаты задают количественные ориентиры для оценки термической нагрузки и могут быть использованы при обосновании безопасных режимов работы лазерных твизеров в экспериментах с эритроцитами.

5. Заключение

Лазерные твизеры и микроскопы ближнего ИК диапазона можно использовать в качестве неинвазивного биомедицинского инструмента для оптических микроманипуляций различными биологическими объектами, диагностики, фотохимии и хирургии. Очевидно, что микроскопия на основе лазеров ближнего ИК диапазона обладает большим потенциалом в области биотехнологий, клеточной биологии и медицины.

В нашем исследовании показано, что лазерное излучение, воздействующее на клетку, может значительно изменять температуру как самой клетки, так и окружающей среды. Несмотря на принятые допущения о сферической геометрии, модель адекватно описывает кинетику нагрева и демонстрирует критическую важность точного знания коэффициента поглощения гемоглобина. Установленный факт следует учитывать при разработке экспериментов.

The additional file for this article can be found as follows: