1. Введение

Разработка функциональных пищевых продуктов в настоящее время ориентирована не только на повышение содержания биологически активных веществ (БАВ), но и на обеспечение их стабильности и высокой биодоступности в составе пищевых матриц. Многие фитохимические соединения, обладающие выраженной антиоксидантной и протекторной активностью, характеризуются низкой устойчивостью к воздействию технологических факторов (температура, кислород, свет) и условиям желудочно-кишечного тракта, что существенно ограничивает их практическое применение в пищевой промышленности

[1]

Соцветия брокколи (

[2][3]

Экстракты

[4][5]

В связи с этим особую актуальность приобретает применение различных способов инкапсулирования, направленных на защиту чувствительных соединений, повышение их стабильности и обеспечение контролируемого высвобождения в желудочно-кишечном тракте. Два перспективных способа инкапсулирования, которые в настоящее время активно развиваются — микроэкструзия в альгинаты и образование липосом под действием ультразвука. Альгинаты — природные анионные полисахариды бурых водорослей — применяются для формирования гелеобразных микрокапсул, обеспечивающих барьерную защиту инкапсулированных компонентов и возможность регулирования кинетики высвобождения

[6][4][7][8]

Цель работы — исследование вариантов инкапсулирования экстракта соцветий

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи: исследовать содержание БАВ в экстрактах корня горца японского и соцветиях брокколи; выполнить и охарактеризовать инкапсулирование экстрактов в микрокапсулы и липосомы для использования в качестве функциональных пищевых ингредиентов; определить биодоступность инкапсулированных БАВ в составе функциональных ингредиентов в условиях ЖКТ

2. Методы и принципы исследования

Исследования проводились в Университете ИТМО на базе лабораторий Мегафакультета наук о жизни, а также международного научного центра «Биотехнологии третьего тысячелетия».

Объектом исследования выступало растительное сырье: высушенные соцветия брокколи сорта

Для получения экстрактов брокколи и горца использовали 70%-ную водно-этанольную смесь. Экстракцию проводили в ультразвуковой ванне (Град 28–35). Экстракт из сухих соцветий брокколи получали при параметрах: мощность 35 кГц и 100 Вт, время 30 с, температура 21 °С, гидромодуль 1:25. Данные параметры были ранее получены путём трехфакторной оптимизации и нахождения уравнения регрессии

[9]

Анализ БАВ выполняли с применением высокоэффективной жидкостной хроматографии с диодно-матричным детектором — ВЭЖХ-ДМД (Shimadzu LC-20, детектор SPD-M20A, колонка Supelco C18) и спектрофотометрическим методом (Shimadzu UV-2600) с реактивом Фолина-Чокальтеу. Условия ВЭЖХ-ДМД: режим градиентный 0–30 мин — 10-35% растворитель В, 30–40 мин — 70% растворитель В; растворитель А — 0,025% трифторуксусная кислота, растворитель В — ацетонитрил; скорость потока 0,8 мл/мин; длина детектирования 306 нм. Для проведения колориметрической реакции аликвоту 1 мл исследуемого экстракта вносили в мерную колбу объемом 25 мл, после чего добавляли реактив Фолина-Чокальтеу (1:10) в пятикратном разведении. Через 5 мин в систему вводили 7%-ный раствор карбоната натрия в том же объеме и тщательно перемешивали. Содержимое колбы доводили до метки экстрагентом и выдерживали в темноте в течение 2 ч для проведения реакции. Интенсивность окраски регистрировали спектрофотометрически при 765 нм

[8]

Количественное определение флавоноидов проводили по аналогичной методике с использованием в качестве комплексообразователя хлорида алюминия. Интенсивность окраски регистрировали спектрофотометрически при 420 нм.

Для оценки антиоксидантной активности использовали способность антиоксидантов нейтрализовать свободные радикалы, при использовании реактива DPPH или 2,2-дифенил-1-пикрилгидразил. Раствор DPPH в этаноле использовали в концентрации 0,01 ммоль/л. Раствор DPPH в объеме 3,9 мл приливали к 0,1 мл каждого экстракта и оставляли на 15 мин в темном месте. Оптическую плотность измеряли на спектрофотометре (Shimadzu UV-2600) при длине волны 517 нм. Степень ингибирования свободных радикалов рассчитывали по формуле (1):

где

Инкапсулирование БАВ из экстрактов горца японского проводили в несколько этапов. Первым этапом концентрировали водно-этанольный 70% экстракт на ротационном вакуумном испарителе (Buchi Rotavapor R-300). Затем полученный водный экстракт (40 мл) смешивали с раствором 2% лецитина в ацетатном буфере (60 мл). После чего смесь диспергировали (T 25 ULTRA-TURRAX) 10 мин при 10000 об/мин и проводили ультразвуковую гомогенизацию (Bandelin Sonopuls mini20) в течение 30 мин переменным импульсом. Полученные липосомальные капсулы замораживали при -80 °С в течение 12 ч, а затем лиофилизировали (Buchi Lyovapor L-200 Pro) в течение 24 ч при 25 Па.

Процесс инкапсулирования экстрактов брокколи также состоял из нескольких этапов. Инкапсулирование экстракта брокколи (

Для определения эффективности инкапсулирования полученных жидких и лиофилизированных липосом, жидкую смесь липосом центрифугировали (Eppendorf MiniSpin) в течение 2 ч при 13300 об/мин. Лиофилизированные восстанавливали в ацетатном буфере и аналогично центрифугировали. Супернатант отделяли от липосом. Осажденные липосомы разрушали с помощью хлороформа и метанола 1 к 1, ожидая полного растворения.

Эффективность липосомального инкапсулирования рассчитывали по формуле (2):

где

Эффективность инкапсулирования микрокапсул с брокколи оценивали по сохранности БАВ после их формирования. В качестве аналитических показателей использовали суммарное содержание фенольных соединений и общее содержание глюкозинолатов. Количество фенольных соединений определяли спектрофотометрическим методом с применением реактива Фолина–Чокальтеу. Результаты выражали в пересчете на галловую кислоту. Содержание глюкозинолатов определяли аналогичным спектрофотометрическим методом с использованием гексацианоферрата(III) калия в качестве комплексообразователя; расчет проводили в пересчете на синигрин.

Эффективность инкапсулирования (E, %) рассчитывали по формуле (3), как отношение суммарного содержания БАВ, обнаруженных в капсулах, к их количеству в исходной смеси для инкапсулирования:

где

Для анализа 1 г микрокапсул растворяли в 2%-ном растворе цитрата натрия. Объем растворителя подбирали с учётом диаметра частиц: для капсул размером 300 и 400 мкм использовали 15-кратный объем, для капсул диаметром 200 мкм — 25–кратный. После полного растворения оболочки из полученных растворов отбирали аликвоты для проведения реакций комплексообразования. Оптическую плотность образовавшихся комплексов измеряли на спектрофотометре при соответствующих длинах волн.

Исследование биодоступности функционального пищевого ингредиента в капсульной и липосомальной формах проводили с помощью модели

Эксперименты проводили с использованием модельного раствора, имитирующего ионный состав ротовой полости (140 ммоль/л NaCl и 5 ммоль/л KCl). Навеску лиофилизированных липосом массой 0,5 г вводили в 13,5 мл указанного раствора, после чего данную смесь помещали в лабораторный шейкер VXR basic Vibrax (IKA), со скоростью перемешивания 100 оборотов в минуту при 37 °С в течение 2 мин, после чего отбирали пробу на анализ. Затем к полученной смеси добавляли 4,5 мл модельного желудочного сока (состоящий из пепсина 144 мг с соляной кислотой, pH 2), после чего смесь инкубировали в течение 60 мин при постоянном перемешивании. По завершении инкубации отбирали вторую пробу в объеме 1 мл и вводили в систему 4,5 мл модельного кишечного сока (состоящий из фосфатного буфера, pH 7,5, содержащий 107 мг панкреатина и 116 мг солей свиной желчи). Смесь выдерживали в термостате 90 мин, после чего отбирали конечную аликвоту 1 мл для последующего анализа.

Биодоступность биологически активных веществ из микрокапсул оценивали в условиях, моделирующих последовательные отделы желудочно-кишечного тракта

[10]

Количество высвобожденных фенольных соединений и глюкозинолатов определяли спектрофотометрически и рассчитывали их содержание относительно исходной массы БАВ, внесенной с 2 г микрокапсул. Биодоступность

Для оценки установленных условий и сроков хранения ингредиента, полученные лиофилизированные липосомы и альгинатные микрокапсулы помещали в темную тару и хранили в темном прохладном месте последующие 3 недели при 23 ± 1 °С. По истечении времени, образцы анализировали на содержание биологически активных веществ с целью определения степени их сохранности и возможных потерь.

Была также проведена микробиологическая оценка функциональных ингредиентов. Общее количество мезофильных аэробных и факультативно-анаэробных микроорганизмов (КМАФАнМ) определяли по ГОСТ 10444.15–94, бактерии группы кишечной палочки — по ГОСТ 31747–2012, плесени и дрожжи — по ГОСТ 10444.12–2013. В качестве питательных сред использовали питательный агар (для КМАФАнМ), агар Эндо (для БГКП) и агар Сабуро (для плесеней и дрожжей). Исследования выполняли для свежеполученных капсул и липосом, после их высушивания и по окончании 3 недель хранения. Дополнительно рассчитывали потери целевых БАВ на этапах сушки и хранения.

Полученные образцы подвергали органолептической для определения дозировки внесения инкапсулированного ингредиента в конечные продукты — творожный сыр и ряженку.

Для получения творожного сыра без стадии созревания использовали следующую рецептуру (из расчёта на 1000 мл молока). В качестве основного сырья применяли пастеризованное коровье молоко объёмом 1000 мл, соответствующее требованиям ГОСТ 32922-2014. Для сквашивания вносили бактериальную закваску CBL2 в количестве 10 мг (в соответствии с ГОСТ 32922-2014 на закваски для молочной продукции). С целью регулирования кислотности и улучшения консистенции добавляли поваренную пищевую соль (ГОСТ Р 51574-2000) в концентрации 1% от массы молока, а также хлорид кальция (ГОСТ 4161-77) в количестве 0,4% для активации сычужного фермента и усиления гелеобразования. Все ингредиенты использовали в строгом соответствии с действующими стандартами, что обеспечивало воспроизводимость технологических параметров и стабильность качества готового продукта.

Также использовали готовый пищевой продукт — ряженка «Большая кружка» 4%, производитель «Галактика» (Россия). Продукт изготавливается по ГОСТ 31455-2012 «Ряженка. Технические условия».

Органолептическая оценка микрокапсул и нанокапсул, внесенных в состав пищевых продуктов проводилась согласно ГОСТ ISO 6658-2016. С помощью слепых дегустаций десять отобранных испытателей описывали качества продукта согласно дескриптору, включающего в себя балльную оценку показателей качества и описание поставленной оценки, заполняя дегустационный лист. В качестве балльной шкалы была использована 5 балльная оценка, где 5 — отлично, 4 — хорошо, 3 — удовлетворительно, 2 — плохо, 1 – очень плохо, что позволяло объективно оценить качество продукции.

Для определения количественных характеристик ингредиента использовали коэффициенты весомости. При расчете сумма всех коэффициентов должна быть равна 1.

Органолептическую оценку показателей качества продукта вычисляли по формуле (4):

где

Продукт считается качественным, при высоком показателе

Все определения проводили не менее чем в трехкратной повторности. Результаты обрабатывали средствами математической статистики и признавали значимыми при

3. Основные результаты и обсуждение

При создании пищевых ингредиентов функционального назначения уделяют особое внимание содержанию и сохранению биологически активных веществ в них. Так, фенольные соединения относятся к классу физиологически активных веществ, для которых характерна высокая активность: они обладают бактерицидным действием, проявляют Р-витаминную активность и выраженные антиоксидантные свойства. Количественный анализ с помощью ВЭЖХ-ДМД позволил установить, что основной группой полифенольных соединений в горце японском являются стильбены, а ресвератрол находился в связанной форме в виде гликозидов (рис. 1), обладающих более высокой биодоступностью по сравнению с чистым агликоном-ресвератролом

[11][12]

[13][13][14]

Также спектрофотометрически с помощью реактива Фолина-Чокальтеу было определено общее содержание полифенольных соединений в исследуемых экстрактах брокколи и горца японского. Данные представлены в таблице 1.

На основе данных химического анализа и наличия стильбенов в составе полифенольных соединений, была предложена липосомальная форма инкапсулирования БАВ горца японского. Инкапсулирование фенольных соединений, в особенности стильбенов, обеспечивает их защиту от окисления и сохранение биодоступности

[15][16][17][18]

Процесс инкапсулирования фенольных соединений включал концентрирование полученного экстракта, с последующим формированием липосом с помощью методики ультразвуковой гомогенизации и финальную лиофилизацию. В результате были получены липосомы с экстрактом горца японского в сухой лиофилизированной форме, представленные на рисунке 2А. Липосомы имеют желтоватую окраску, вызванную аддитивным пигментным вкладом исходных компонентов — раствора соевого лецитина и концентрата корневого экстракта со стильбенами. Полученные цветовые профили учитывались как критический параметр сенсорного соответствия при внесении ингредиентов в пищевые матрицы, поскольку сохранение эстетических и потребительских характеристик готовой продукции обеспечивает конкурентоспособность на рынке. Для инкапсулирования экстракта соцветий брокколи было решено использовать экструзию в раствор-отвердитель с получением альгинатных микрокапсул, которые характеризовались правильной сферической формой и ярко-зеленой окраской, обусловленной сохранением природных пигментов и полифенольных соединений экстракта. На рисунке 2С представлена оценка размеров полученных микрокапсул (микроскоп Полар-1), а на рисунке 2Б видна интенсивность цвета микрокапсул, что может рассматриваться как косвенный показатель сохранности БАВ

[19][20]

[11][21][22]

Для оценки биодоступности БАВ проводилось исследование на модельных растворах ЖКТ

Аналогичные эксперименты на моделях ЖКТ

[19]

Для подтверждения сохранности БАВ при хранении липосом и микрокапсул образцы выдерживали при температуре 23 ± 1 °С в течение 3 недель в герметичных тарах. По истечении времени во всех образцах измеряли содержание БАВ. Данные представлены в таблице 2. Содержание БАВ в обоих видах систем доставки оставалось практически без изменений. В исследовании

[23]

Результаты микробиологического анализа показали, что уровень КМАФАнМ в лиофилизированных липосомах и микрокапсулах не превышает 5×104Missing Mark : sup КОЕ/г, что соответствует требованиям ТР ТС 029/2012 к безопасности пищевых ингредиентов. В результате анализа БГКП, а также плесневые грибы и дрожжи обнаружены не были. Таким образом, продукт признан микробиологически безопасным для использования в качестве функционального пищевого ингредиента.

Оценку пригодности разработанных ингредиентов к использованию и их сравнительный анализ осуществляли на основе органолептических свойств капсул в составе ряженки и творожного сыра. Заявленные продукты выбраны по причине схожести цвета функциональных ингредиентов и возможного взаимодействия полифенолов и молочнокислых бактерий, что может способствовать усилению полезных для здоровья эффектов или подавлению роста патогенных микроорганизмов

[16][21][24][25]

В соответствии с Методическими рекомендациями MP 2.3.1.0253-21 «Нормы физиологических потребностей в энергии и пищевых веществах для различных групп населения Российской Федерации» суточной нормой адекватного потребления глюкозинолатов (индол-3-карбинол) 50 мг/сутки, а стильбенов 2 мг/сутки. Функциональным пищевым продуктом считается тот, в котором содержание функционального ингредиента варьируют количестве от 15% до 50%. Образец без добавки (0%) использовали в качестве контрольного для обеспечения корректной сравнительной оценки полученных результатов. Липосомы вносили в количестве, обеспечивающем 16% и 32% адекватной суточной нормы потребления стильбенов на порцию ряженки 100 мл, что эквивалентно 0,32 мг и 0,64 мг ресвератрола и его гликозидов соответственно и 0,8 г и 1,6 г лиофилизированных липосом. Микрокапсулы с экстрактом брокколи вносили в творожный сыр в количестве 0, 1, 3 и 5% от массы продукта с целью установления закономерностей влияния дозировки функционального ингредиента на органолептические показатели продукта. Результаты оценки органолептических характеристик образцов творожного сыра, изготовленных без функционального ингредиента и с добавлением микрокапсул, как показано в таблице 3.

Концентрация 1% выбрана как минимально значимая с точки зрения проявления функциональных свойств и оценки порогового влияния на структуру и сенсорные характеристики. Уровень 3 % рассматривали как промежуточную технологически обоснованную дозировку, обеспечивающую выраженный эффект обогащения при сохранении потребительской приемлемости. Концентрация 5% для продукта с капсулами и 1,6 г для продукта с липосомами определена как верхний предел внесения, позволяющий оценить предельные изменения органолептических свойств без критического нарушения консистенции продукта. В 1 г капсул содержится 10,8 мг глюкозинолатов.

Органолептическая оценка показала различное воздействие добавок на сенсорные характеристики продуктов в зависимости от типа матрицы. Десяти отобранным испытателям, предлагалась дегустация по выбранным дескрипторам (общее впечатление, внешний вид, запах, вкус, консистенция) идентифицировать образцы с функциональными ингредиентами, указав их номер и доминирующие признаки в анкете. Почти 90% экспертов корректно распознали ряженку с добавкой, отметив в качестве ключевого отличия её слегка более желтоватый оттенок по сравнению с контрольным образцом. Отличительный желтоватый цвет пищевого ингредиента связан с использованием лецитина и экстракта горца японского. Однако, согласно незначительным изменениям органолептических показателей качества в составе пищевой матрицы, полученные данные согласуются с результатами других исследователей. Например, в работе

[26][27][28]

Творожный сыр с ингредиентом распознали 85 % дегустаторов; по балльной шкале вкусовая оценка обогащенных образцов оказалась ниже, чем у образца ряженки с липосомальными капсулами. Органолептическая оценка показала, что образцы с внесением 1% и 3% микрокапсул сохраняли однородную кремообразную консистенцию, характерный кисломолочный вкус и аромат, однако при дозировке уже от 5% наблюдалось уплотнение текстуры и появление легкого растительного оттенка во вкусе готового продукта.

На основании комплексной оценки установлено, что рациональной является дозировка для творожного сыр 3% микрокапсул, обеспечивающая достижение функционального уровня без значимого ухудшения потребительских свойств. При добавлении липосомального пищевого ингредиента в количестве 0,8 и 1,6 г отмечается, что органолептические показатели изменяются незначительно, что подтверждает возможность его применения в пищевых продуктах в указанных дозах.

При сравнительном анализе установлено, что альгинатные микрокапсулы с экстрактом брокколи обеспечивают эффективную защиту глюкозинолатов и фенольных соединений при хранении и моделировании условий желудочно‑кишечного тракта, а их внесение приемлемо для потребителя влияет на цвет и консистенцию творожного сыра, что делает данную форму удобной для использования в продуктах с нейтральными органолептическими характеристиками. В то время как липосомальная форма экстракта горца японского, напротив, продемонстрировала более высокую степень сохранности стильбенов (в том числе ресвератролозида и транс‑ресвератрола) и улучшенную биодоступность

[24][28]

Полученные данные подтверждают высокий внедренческий потенциал разработанных ингредиентов в пищевых системах. Минимальная заметность в ряженке на фоне улучшения вкусового профиля свидетельствует о перспективности применения липосом, как пищевого ингредиента, для функциональной обогащенности без ущерба для потребительских предпочтений. Микрокапсулы с экстрактом брокколи в дозировке до 3% оказались приемлемыми для использования в составе творожного сыра, что также подтверждает их технологическую совместимость.

4. Заключение

В результате проведенных исследований проводилась разработка функциональных пищевых ингредиентов на основе растительных экстрактов брокколи (

В дальнейшем необходимо проведение комплексных исследований, направленных на углубленное изучение механизмов абсорбции, транспорта и метаболизма инкапсулированных биологически активных веществ. Особое внимание необходимо уделить фармакокинетическим параметрам систем доставки в ходе

The additional file for this article can be found as follows: