1. Введение
Количество и разнообразие заболеваний суставов, приводящих к деформирующим последствиям, растет быстро, а возраст лиц страдающих ими снижается
[1][2]
В работе
[3][4][5]
Физиологическая роль солевой формы аскорбиновой кислоты проявляется, в частности, во всасывании и транспорте АК через натрий-зависимые ко-транспортеры: SVCT1 и SVCT2 — мембранные белки, отвечающие за ее активный захват
[6][7][8]
Роль аскорбиновой кислоты в стабилизации равновесия в синовии в литературе обсуждена недостаточно. Специфической функцией является гидроксилирование остатков лизина и пролина при синтезе коллагена в синовиальной жидкости
[9][10][5][11]
Основной компонент, обеспечивающий вязкость и смазывающие свойства синовиальной жидкости — гиалуроновая кислота — образует ось гигантской молекулы протеогликана
[12][13]
Раскрытие механизма действия АК в водных растворах имеет принципиальное значение для описания гомеостаза синовиальной жидкости. В качестве рабочих подходов используем потенциометрию и методы квантовой химии
[14]
Отсюда, целью настоящей работы является демонстрация полифункциональности аскорбиновой кислоты — Н-кислоты, основания, окислителя, восстановителя и лиганда — в составе универсальной буферной системы синовиальной жидкости.
2. Методы и принципы исследования
Для проведения потенциометрического исследования растворы аскорбиновой кислоты, марки «РМ Инжиниринг», CAS 50-81-7, Китай, готовили в разведениях от 5% до 0,005% методом отдельных навесок и методом разведений в деионизированной воде. Раствор гидроксида натрия готовили из стандарт-титра в деионизированной воде непосредственно перед исследованием. Дегазация растворов проводилась методом барботирования азотом.
Потенциометрические измерения проводились на рН-метре/иономере ИТАН «Томьаналит». В электродную ячейку включен стеклянный комбинированный электрод ЭСК-10605.
Для проведения квантово-химического моделирования, расчета количественных характеристик молекулярных систем избраны стандартные методы ab initio — Хартли-Фок (RHF) и пост Хартли-Фок (MP2), которые чередовали с расчетами по теории денситной функции (DFT) B3LYP. В качестве граничного, использован полуэмпирический метод RPM6 (табл. 1). Расчеты проводили для изолированных систем и в режиме «solvation» для среды «вода» в режиме «FREQ» и «FOPT».
В качестве исходного объекта в квантово-химическом исследовании избрана левовращающая аскорбиновая кислота, ее солевая и окисленная формы.
Характеристики примененных программных методов расчета
| Метод расчета | RHF | RМP2 | RB3LYP | RPM6 |
| Тип расчета | FREQ | FREQ | FREQ | FOPT |
| Базис | 6-31G | 6-31G | 6-31G | ZDO |
3. Основные результаты
По результатам проведенного нами потенциометрического алкалиметрического исследования АК
[15][13]
Результаты потенциометрического исследования растворов АК в разведениях от 5% до 0,005% (растворы готовили методом отдельных навесок и методом разведений) (рис. 1), показали нелинейность зависимости рН растворов от логарифма концентрации аскорбиновой кислоты: зона явной стабилизации значений рН в диапазоне малых концентраций аскорбиновой кислоты отражает формирование системы с буферными свойствами. Система ведёт себя как классический раствор слабой кислоты и pH раствора отражает возникновение баланса между восстановленной формой АК и аскорбат анионом без учета окислительно-восстановительных процессов, несомненно, присутствующих в более сложных системах на базе аскорбиновой кислоты в составе синовиальной жидкости. Разные способы приготовления раствора дают схожие pH-профили. Значения pH на графике в диапазоне 2–4,5 близки к показателю константы кислотности (pKa₁ ≈ 4.17), что типично для буферных растворов аскорбиновой кислоты.
Потенциометрическая зависимость рН от логарифма концентрации аскорбиновой кислоты в водных растворах, приготовленных методом разведения (этапы разведения показаны стрелками) из исходных растворов 0,5, 0,2 и 0,05 моль/л без доступа стороннего кислорода, в деионизированной водной среде
Расширение структурных представлений о АК за счет квантово-химического моделирования методом RPM6 в водной среде (рис. 2) позволило выявить следующее: увеличение прочности ковалентной связи кислорода с углеродом (С3) кольца восстановленной формы АК за счет формирования полуторной связи на фоне разрушения сопряженной с ней ковалентной связи «О-Н».
Оптимизация структур АК (слева) и ДГАК (справа) методом RPM6
Перераспределение электронной плотности аскорбиновой кислоты в водной среде отражает предпосылки к последующей полной ионизации до аскорбат иона, что соответствует полученным ранее потенциометрическим данным. В результате, наблюдаем усиление полярности связей C–O и C–H; повышение реакционной способности гидроксильных групп. Благодаря положительному мезомерному эффекту (+M) гидроксильные группы повышают электронную плотность в сопряжённой системе, отрицательный мезомерный эффект (-M) от карбонила смещает электронную плотность от соседних атомов, создавая динамическое равновесие между резонансными структурами (перераспределение электронной плотности). Причем, при рН 7,5 депротонирование должно усиливать мезомерный эффект за счет возможности миграции отрицательного заряда по сопряжённой системе, увеличивать нуклеофильную активность молекулы.
Сопоставляя индукционные и мезомерные процессы в молекуле аскорбата натрия отметим, что индукционный и мезомерный эффекты в области карбонила: –I (оттягивание электронов) и –M (акцептирование электронов) усиливают электрофильный характер углерода C=O; в области гидроксильных групп: +M (донор эффект) и –I (оттягивание электронов) создают баланс между нуклеофильной и электрофильной реакционной способностью: гидроксильные группы (особенно ендиольные) —преимущественно нуклеофилы, в то время, как карбонильный углерод (C=O) представляет собой электрофильный центр.
Таким образом, индуктивный эффект поддерживает полярность и локализацию зарядов, влияя на реакционные центры, а мезомерный эффект обеспечивает эффект сопряжения, что стабилизирует анион аскорбата, сохраняя способность к координационным взаимодействиям и лёгкость его окисления. В то же время возникает некоторая стабилизация системы за счёт натрия. При визуализации оптимизированной структуры аскорбата натрия в водной среде, катион расположился строго под лактонным кольцом, т.к. в этом месте наблюдается наибольшее скопление электронной плотности. Практически в водной среде в присутствии иона натрия формируется ионный ассоциат.
Результат расчета состояния дегидроаскорбиновой кислоты в водной среде (рис. 2) показал определенную устойчивостью ДГАК. В условиях синовиальной жидкости проявит себя −М‑эффект карбонильных групп ДГАК, способный создать распределённые электрофильные центры; что усиливает реакционную способность молекулы, ускоряя её гидратацию, полукетализацию и, возможный, последующий гидролиз. Исходя из данной структуры, сочетание −М‑ и −I‑эффектов определяет потенциальную биологическую судьбу ДГАК: её основной окислительно-восстановительный потенциал, возможности транспортировки, восстановления и потенциального распада в составе синовиальной жидкости. Отметим, что для устойчивости дегидроаскорбиновой кислоты более комфортной может быть слабокислая среда на уровне рН 6,8–6,9. С повышением рН ДГАК становится менее стабильной, что повышает ее реакционный потенциал, необходимый для стабилизации метаболических процессов в синовии. Таким образом, −М‑ и −I‑эффекты в сочетании с метаболическими особенностями синовиальной жидкости напрямую управляют химическим потенциалом, биологической активностью ДГАК.
Далее были проведены квантово-химические расчеты при введении в исходный файл двух и трех молекул. В качестве примера приведем визуализацию расчета пары «Аскорбат — Na и ДГАК» методом RHF. Как видно на рис. 3, катион встраивается между двумя молекулами, формируя «слоистую» структуру ионной системы с ассоциированными анионами, т.е. ионный ассоциат.
Оптимизация строения системы аскорбата натрия и ДГАК методом Хартри-Фока (RHF)
Данная система представляет собой равновесный обратимый процесс перехода «аскорбат натрия — дегидроаскорбиновая кислота» и отражает эффективный короткодействующий редокс-буфер с высокой реакционной способностью, играющий ключевую роль в поддержании окислительно-восстановительного гомеостаза в составе синовиальной жидкости.
В тройной системе аскорбиновая кислота, аскорбат натрия и дегидроаскорбиновая кислота после расчетов равновесной структуры в водной среде методом RPM6 также прошли изменения. Аскорбиновая кислота преобразуется в аскорбат натрия за счет потери иона водорода и формирования полуторной связи С-О (рис. 4 слева). Аскорбат-ион окисляется до аскорбат радикала (рис. 4 справа) с двумя полуторными связями С-О. Хотя сама ДГАК структурно никак не изменилась (рис. 4 центр), привлекает внимание расположение иона натрия строго напротив лактонного кольца дегидроаскорбиновой кислоты в качестве уравновешивающего фактора всей трехкомпонентной системы. Эти структурные преобразования показывают возможность параллельного и одновременного протекания окислительно – восстановительной и ионообменной буферизации, иначе говоря, формирование универсальной буферной системы.
Оптимизация тройной системы АК – АК-Na – ДГАК методом RPM6
На рисунке 5 приведена диаграмма, позволяющая проследить тенденции изменения энергетических состояний равновесных систем в условиях изоляции и водной среды. Наибольшей энергетической устойчивостью обладают трехкомпонентные системы, причем самой устойчивой оказалась система, обладающая наибольшей разнообразностью: «аскорбиновая кислота — аскорбат натрия — дегидроаскорбиновая кислота». Интересно, что соотношение двух восстановленных молекул аскорбиновой кислоты к одной молекуле дегидроаскорбиновой кислоты обладает большей энергетической устойчивостью (равновесностью), чем обратное соотношение одной молекулы восстановленной аскорбиновой кислоты к двум молекулам дегидроаскорбиновой кислоты. Последняя система явно более активна и менее равновесна в водной среде. Отметим, что участие ДГАК, вообще говоря, ведет к повышению энергии системы, что необходимо для восполнения запасов аскорбата натрия и аскорбиновой кислоты, в том числе, в условиях появления в системе сторонних компонентов и процессов, развития окислительного стресса.
Изменение энергии индивидуальных (аскорбиновая кислота (АК), аскорбат натрия (А-Na), дегидроаскорбиновая кислота (ДГАК), двухкомпонентных и трехкомпонентных смесей в изолированном состоянии и в водной среде методом RPM6
4. Обсуждение
Динамическое равновесие между формами АК за счет объединения редокс и ионообменного процессов обеспечивает этой буферной системе стабильность, необходимую для поддержания гомеостаза и, в то же время активное участие в окислительно-восстановительных и протолитических процессах. Например, в синовиальной жидкости необходимо учитывать более широкую возможность окисления, особенно в присутствии ионов Fe²⁺/Cu²⁺, возможное влияние на осмолярность и ионный баланс сторонних компонентных факторов.
Таким образом, максимальное компонентное разнообразие системы «аскорбиновая кислота — аскорбат ион — аскорбат радикал — дегидроаскорбиновая кислота» обеспечивает наибольшую энергетическую устойчивость и стабильность в широком диапазоне рН:
· аскорбиновая кислота (pKa ~4,17) — буферизация в кислой зоне;
· аскорбат-ион — в нейтральной/слабощелочной зоне;
· дегидроаскорбиновая кислота — стабилизация при сдвиге в щелочную сторону,
что, в целом, обеспечивает стабильность синовиальной жидкости (pH ~7,3–7,6).
При этом, компенсационный редокс потенциал этой системы позволяет стабилизировать величину ЭДС синовиальной жидкости, несмотря на сторонние, например, метаболические процессы с признаками патологии.
Отсюда, компенсационная система «аскорбиновая кислота — аскорбат ион — аскорбат радикал — дегидроаскорбиновая кислота» выглядит предпочтительнее, например, при необходимости стабилизации постоянных гипоксических воздействий, опасных развитием процессов анаэробного распада: ростом уровня свободных радикалов, что сопровождает развитие артропатий различного генеза.
Нарушение равновесности, тем более компонентности данной системы ведет к развитию патологических процесоов, чему часто не придают значение во врачебной практике при выборе тактики лечения, оптимального протокола. Понимание механизмов действия универсальной буферной системы позволяет разработать медицинские средства, способствующие ее восстановлению: реконструкция макро/микроэлементного баланса среды, лигандного состава, рН среды и соответствующего буферного обеспечения.
5. Заключение
Тот факт, что у пациентов с артритом в синовиальной жидкости повышается содержание аскорбиновой кислоты с одновременным ее снижением в крови говорит о необходимости АК для восстановления гомеостаза. При этом возникает аномально высокое соотношение окисленной формы АК к восстановленной (до 80%). При общем дефиците аскорбиновой кислоты наблюдается нарушение целостности синовиальной жидкости, сопряженных с ней хрящевых тканей, а накопление окисленной формы в конечном итоге ведет к метаболическим изменениям в синтезе коллагена, гиалуроновой кислоты и т.д.
Данные представления позволяют сформировать универсальный базис для разработки трансдермально вводимой композиции, способной адаптироваться в составе ферментативного комплекса синовиальной жидкости. Конструирование медицинских средств, способных создать условия для ремиссии при артрите должно быть основано на реконструкции отдельных компонентов универсальной буферной системы «аскорбиновая кислота — аскорбат ион — аскорбат радикал — дегидроаскорбиновая кислота». Это позволит восстановить самоорганизующие свойства эволюционно сформированного механизма, одновременного поддержания кислотно-основного и окислительно-восстановительного равновесия (гомеостаза) в условиях изменчивого воздействия внешних и внутренних факторов.
Именно многокомпонентность и равновесность стабилизирующей системы обеспечивает ее полифункциональность. Квантово-химическое моделирование позволяет представить себе структурные особенности буферной системы: энергетические характеристики компонентов, способность к стабилизации за счет координационного взаимодействия с микроэлементами. Учитывая, что без соблюдения этих принципов стандартные медицинские средства мало эффективны, Понимание механизма действия буферной системы аскорбиновой кислоты позволяет разработать способ нормализации метаболических процессов с адекватным буферным сопровождением. Решение данной задачи возможно с применением квантово-химических методов, позволяющих рассчитать оптимальную молекулярную структуру, способную, будучи введенной в синовию, активизировать позитивную модификации метаболических процессов.