1. Введение

На сегодняшний день в мире одним из перспективных биотехнологичеcких направлений для получения целевых продуктов питания животных и человека является микроводоросль Chlorella [1], [3], [4], [5]. Культивирование микроводорослей является экономически оправданным и стратегически необходимым элементом в биоэкономике России. Особенностью хлореллы является ее способность производить различные биологически ценные компоненты, получаемые путем изменения состава питательной среды [6], [9], [13], [17].

В сухой биомассе микроводоросли содержится до 55% белка, 25% углеводов, 12% липидов и до 8% минеральных веществ. При изменении концентрации компонентов питательной среды можно получить биомассу широкого спектра состава: 9–88% белка, 5–86% липидов, 6–38% углеводов. Белок микроводоросли по качеству не уступает известным растительным белкам, так как содержит все необходимые аминокислоты, в том числе незаменимые, а также наиболее ценные для человека и животных полиненасыщенные жирные кислоты, такие как арахидоновая, линолевая и линоленовая, эйкозапентаеновая и докозагексаеновая. В литературе описано, что в 100 г общего белка хлореллы содержится: 6,4 г аспарагиновой аминокислоты; 6,2 г глицина; 7,7 г аланина; 7,8 г глутаминовой аминокислоты; 3,3 г серина; 2,8 г триозина; 5,8 г пролина; 0,2 г цистина; 5,5 г валина; 15,8 г аргинина; 3,3 г гистидина; 3,5 г изолейцина; 6,1 г лейцина; 10,2 г лизина; 1,4 г метионина; 2,8 г фенилаланина; 2,9 г треонина; 2,1 г триптофана [1], [2], [3], [4].

Хлорелла содержит природные соединения, обладающие свойствами антибиотиков. Синтезируемый ею комплекс БАВ под названием «хлореллин» уничтожает патогенную микрофлору: в концентрации 1:500000 и 1:1000000 он эффективен против стрептококков, стафилококков, кишечной палочки и возбудителя туберкулеза [14], [15], [16].

Культура хлореллы не особо требовательна к питательной среде и рН, оптимальная температура для роста 20–28 °С, культивируется как при естественном, так и искусственном освещении в лабораторных условиях и не зависит от сезона года. При достижении плотности клеток трех млн/мл проявляются антагонистические свойства к другой альгофлоре, бактериям и инфузориям, по данной причине при культивировании Chlorella не требуются стерильные условия [9], [11], [13], [16].

Стойкого цикла развития культура данной микроводоросли не имеет, в культуре развивается в основной массе асинхронно и эту особенность можно использовать для установления процесса синхронизации и соответственно увеличения выхода биомассы. Соответственно, изменяя питательный режим, освещенность и формат культивирования можно получать больший объем не только отдельных необходимых человеку и животным компонентов, но и полноценный суперфуд для питания людей [5], [9], [12], [16].

Аминокислоты рассматривали как потенциальный высокоэффективный нанотехнологичный (очень низкие концентрации) регуляторный инструмент для синхронизации в культуре, повышения скорости роста и увеличения производства биомассы микроводоросли, и в частности глюкогенные [1], [6], [11], [15].

Целью исследований является изучение влияния глюкогенных, кетогенных и смешанного типа генности аминокислот на жизненный цикл хлореллы путем их экзогенного внесения в стандартный питательный раствор Тамия.

2. Основная часть

Из литературных данных известно, что высокий уровень усвоения питательных веществ различными организмами обеспечивают в первую очередь такие аминокислоты, как глютаминовая кислота, лизин, гистидин, метионин, глицин, которые при соприкосновении с микроэлементами образуют хелатные соединения. Положительное влияние на метаболизм растений оказывают валин, триптофан, треонин, серин, пролин, аланин, аденин, аргинин, фенилаланин и тирозин. Они способствуют скорейшему восстановлению в стрессовых ситуациях.

Как известно из курса биохимии и молекулярной биологии, существует много специфических путей катаболизма аминокислот по боковой цепи, но в конечном итоге в процессе жизнедеятельности изучаемой микроводоросли они сходятся к шести продуктам, которые вступают в цикл трикарбоновых кислот и при определенных условиях участвуют опосредовано в синтезе глюкозы и кетоновых тел (рис.1).В соответствии с этим для нашего опыта были взяты следующие аминокислоты – глутаминовая кислота (1), аргинин (2), аланин (3), треонин (4), валин (5), лизин (6), глицин (7), метионин (8), триптофан (9), аспарагиновая кислота (10), фенилаланин (11) и пролин (12) в концентрациях 0,001, 0,0001 и 0,00001% по массе.

Аминокислоты вносились отдельно друг от друга в питательную среду непосредственно в начальный момент культивирования культуры микроводорости Хлореллы. Концентрация по показателю оптической плотности составила 0,6 отн.ед.

В ходе лабораторных исследований проводилось культивирование микроводоросли на питательной среде Тамия. Наращивание биомассы микроводоросли проводилось в 3-х кратной повторности в течение 3 суток. В течение всего времени культивирования проводилось измерение оптической плотности, которое отражает количество биомассы клеток в 1 мл культуры. Измерения оптической плотности производили через каждые 8 часов (рисунок 2).

Согласно полученным данным установлено, что все внесённые аминокислоты оказали положительное воздействие в данных изучаемых концентрациях на культуру микроводоросли.

В целом установлена положительная динамика влияния протеиногенных аминокислот на рост и развитие культуры микроводоросли. В изучаемой концентрации 0,001% масс. наибольшее влияние на скорость роста и прирост биомассы оказали аминокислоты глутаминовая кислота, аргинин, аланин, треонин, валин, триптофан, аспарагиновая кислота, фенилаланин и пролин.

В изучаемой концентрации 0,0001% масс. наибольшее влияние на скорость роста и прирост биомасы оказали аминокислоты аланин, треонин, валин, триптофан, аспарагиновая кислота, фенилаланин и пролин.

В изучаемой концентрации 0,00001% масс. наибольшее влияние на скорость роста и прирост биомасы оказали аминокислоты глутаминовая кислота, аргинин, аланин, треонин, валин, триптофан, аспарагиновая кислота, фенилаланин и пролин.

Можно сделать вывод о том, что аминокислоты треонин, валин, триптофан, аденин, фенилаланин и пролин независимо от вносимой концентрации, оказывали устойчивый положительный эффект ускорения роста и синхронизации культуры хлореллы.

Были рассчитаны средние удельные скорости роста культуры в зависимости от внесенных аминокислот (рисунок 3). Удельную скорость роста водорослей Vуд рассчитывали по уравнению (1) [18], [19], [20]:

где D0 и Dt — исходная концентрация клеток и их концентрация через время t, t — время между измерениями, часах.Исходя их данных опыта с концентрацией 0,001% масс. на построенных диаграммах видно, что наибольшая удельная скорость роста наблюдается при внесении следующих аминокислот: глутаминовая кислота, аргинин, аланин, треонин, валин, триптофан, аденин, фенилаланин и пролин. А наименьшая удельная скорость роста - при внесении лизин, глицин, метионин (рисунок 2).

В опыте с концентрацией 0,0001% масс. из диаграмм видно, что наибольшая удельная скорость роста наблюдается при внесении следующих аминокислот: аланин, треонин, валин, триптофан, аспарагиновая кислота, фенилаланин и пролин. А наименьшая скорость роста — при внесении глутаминовая кислота, аргинин, лизин, глицин, метионин (рисунок 2).

В опыте с концентрацией 0,00001% масс. на построенных диаграммах видно, что наибольшая удельная скорость роста наблюдается при внесении следующих аминокислот: треонин, валин, триптофан, аспарагиновая кислота, фенилаланин и пролин. А наименьшая удельная скорость роста — при внесении остальных аминокислот, используемых в опыте (рисунок 2).

Данные по скорости роста согласуются с параметрами по оптической плотности культуры при внесении анализируемых аминокислот.

Полученные результаты имеют большое значение для разработки новых технологий культивирования Chlorella с повышенной эффективностью, что особенно актуально в рамках растущего спроса на экологически чистые продукты питания и возобновляемые источники энергии. Эксперимент открывает перспективы оптимизации промышленных процессов культивирования микроводоросли путём целенаправленного подбора питательных сред и режимов культивации, ориентированных на максимальное использование потенциала хлореллы как продуцента ценных биоресурсов.

Использование флуоресцентных методов анализа весьма актуально для мониторинга физиологических изменений в организмах живых биосиситем и растений

Флуорисценция хлорофилла (ФХ) является удобным, быстрым и весьма информативным параметром, отражающим внутренние механизмы световой реакции фотосинтеза внутри организма (ФС 1 и ФС2), без его разрушения.

Реакцию биологических объектов, в частности микроорганизмов, на изменение условий окружающей среды, питание, температурные режимы можно зафиксировать с помощью измерения данного параметра, который в полной мере отражает фотосинтетические изменения в организме.

Для опыта с аминокислотами с концентрацией 0,00001% масс. проводилось определение параметров флуорисценции. Измеряли несколько парамеров, а именно Fo — это флуоресценция, исходящая от светособирающего комплекса. Fm — максимальная флуоресценция. Fv, переменная флуоресценция = Fm– Fo.

Отношение Fv/Fm — прямая мера оптимальной квантовой эффективности фотосинтеза. Это очень важное свойство, показывающее эффективность протекающих световых реакций. Обычно имеет теоретический максимум значение около 0,83. Относительную вариабельную флуоресценцию (Fv/Fm), характеризующую максимальную квантовую эффективность использования световой энергии, рассчитывали по формуле (2):

Для измерения показателя замедленной флуоресценции ЗФ использовался флуориметр «Фотон-10» («СФУ-Система», Россия). Интенсивность ЗФ измерялась в двух световых режимах: при возбуждении вспышками синего света (480 нм) высокой (ЗФв) и низкой (ЗФн) интенсивности. Длительность световых импульсов в режиме высокого света составляла 20 мс. Импульсы возбуждающего света чередовались с темновыми промежутками в 5 мс, в которые регистрировалась миллисекундная компонента кривых затухания ЗФв.

Полученные результаты представлены на рисунке 4

В режиме низкого света после коротких импульсов светового возбуждения следовали более продолжительные промежутки темноты для обеспечения измерения длительных (секундных) компонент затухания ЗФн. Относительный показатель замедленной флуоресценции (ОПЗФ), измеряемый в течение нескольких секунд, рассчитывается как отношение ЗФвыс к ЗФниз. Данный показатель многократно снижается при подавлении фотосинтеза в растительных клетках и при этом не зависит от концентрации клеток в суспензии микроводорослей хлореллы.

3. Заключение

Исходя их полученных данных, можно сделать вывод об эффективнсоти фотосинтеза хлореллы под влиянием различных аминокислот.

Эксперимент показал, что в присутствии различных аминокислот происходит увеличение интенсивности ЗФ, возбуждаемой светом высокой интенсивности (ЗФв), и увеличение при возбуждении светом низкой интенсивности (ЗФн). В результате этих изменений отношение ЗФв/ЗФн (ОПЗФ) колеблется и максимальные значения проявляются в образцах аргинин, аланин, триптофан, пролин.

Таким образом, использование аминокислот с разной концентрацией при культивировании микроводоросли Хлорелла позволило установить определенную положительную зависимость от концентрации, и наиболее эффективными при всех исследованных концентрациях оказались аминокислоты треонин, валин, триптофан, аденин, фенилаланин и пролин.

Регистрация относительного показателя замедленной флуоресценции (ОПЗФ) хлорофилла позволила выявить высокую чувствительность водоросли Chlorella к различным аминокислотам. Быстрая ответная реакция микроводорослей на изменение условий роста, в частности под влиянием аминокислот, позволяет использовать изменение их структурно-функциональных характеристик в качестве чувствительных индикаторов и диагностировать изменение клеточного метаболизма под влиянием внешних факторов.

Таким образом, проведённое исследование позволило выявить ключевые факторы, определяющие положительный эффект аминокислот на продукцию биомассы хлореллы, что открывает новые возможности для повышения эффективности технологии переработки микроводорослей и создаёт предпосылки для дальнейшего расширения области их применения в экономике и экологии.

The additional file for this article can be found as follows: