1. Введение

Кардиогенный отек легких развивается вследствие повышения гидростатического давления в легочных капиллярах при неповрежденной альвеоло-капиллярной мембране [2], [3], [5], что приводит к фильтрации жидкости в интерстициальное и альвеолярное пространства. Кроме того, высокое гидростатическое капиллярное давление может вызвать разрушение альвеоло-капиллярной мембраны и, как следствие, повышение проницаемости альвеолярного эпителия и эндотелия капилляров [6], [7]. Отечная жидкость в альвеолярном пространстве изменяет функцию сурфактанта и увеличивает поверхностное натяжение, перемещение белков из капилляров в интерстициальное пространство и альвеолы ​​также увеличивает поверхностное натяжение [11], [13]. Разрушение барьера приводит к острому воспалительному процессу, который поддерживает повышенную проницаемость и непосредственно дисфункцию сурфактанта [11]. Таким образом, развитие кардиогенного отека легких приводит к накоплению жидкости через механизмы повышения гидростатической фильтрации и повышения проницаемости альвеоло-капиллярной мембраны.

В настоящее время для гистологических исследований широко используется и метод парафиновой заливки материала и метод криостатной техники подготовки среза [4], [8], [10]. Cтандартные гистологические методы приготовления и окрашивания срезов широко применяются в научных исследованиях для подтверждения отека легких и более глубокого изучения его патогенетических механизмов, поскольку выявляют основные признаки отека интерстиция, отека альвеол и дают представление о морфологической картине существующей патологии [3], [7]. Однако считается, что стандартное окрашивание легочной ткани для гистологического исследования отека легких является неэффективным с позиций невозможности дифференцировки и верифицикации его различных форм развития [9], [12].

Цель исследования состояла в изучении морфологических изменений легочной ткани на парафиновых и криостатных срезах при развившемся гемодинамическом отеке легких у крыс.

2. Методы и принципы исследования

Исследование проведено на 40 взрослых самцах крыс Wistar (220±40 г). Эксперименты одобрены Этическим комитетом ФГБОУ ВО ЯГМУ МЗ России (протокол №69 от 13.09.2024 г.). Всех животных наркотизировали путем однократного внутрибрюшинного введения пентобарбитала натрия (40 мг/кг). После наступления глубокой анестезии животных фиксировали на секционном столике вентральной стороной вверх и разделили на две группы — в каждой по n=20, которым вводили внутривенно однократно 0,9% раствор натрия хлорида (контрольная группа) и 0.05% раствора норэпинефрина в дозе 500 мкг/кг (опытная группа). Через 50 минут от момента введения веществ всем животным выполняли цервикальную дислокацию, торакотомию с последующим извлечением легких. Животных каждой группы разделили на две группы по 10 крыс методом простой рандомизации.

Для гравиметрического исследования оба сырых легких от 10 животных в каждой группе взвешивали на аналитических весах «ACULAB» ALC-210d4 (США) и рассчитывали легочный коэффициент (ЛК) как отношение массы сырых легких к массе животного (мг/г). После сушки легких до их постоянного веса в термостате при температуре 80–90°C рассчитывали индекс водного баланса (ИВБ, мг/мг) [3], сухой остаток (СО, %), индекс отечной жидкости (ИОЖ, мг/г) и прибавку кровенаполнения (ПК, мг/г) [1], [6] (см. рис. 1).

Для гистологического исследования образцы каудальной доли левого легкого от 10 животных в каждой группе использовали для приготовления и криостатных и парафиновых срезов. Для приготовления криостатных срезов применяли стандартный протокол мягкой фиксации: образцы фиксировали в течение 2 часов при 4°C в 4% растворе параформальдегида (водный раствор, получаемый растворением 4 граммов порошка параформальдегида в 0,01 М фосфатно-солевом буфере (ФСБ) pH 7.4 и доведением конечного раствора до 100 мл с нагреванием до 60°C) с последующей трехкратной промывкой в ФСБ суммарно в течение 30 минут и криопротекцией в 30% растворе сахарозы (водный раствор, получаемый растворением 30 граммов сахарозы в ФСБ и доведением конечного раствора до 100 мл) в течение 24 часов при 4°C. Из образцов готовили срезы с помощью криостата «Shandon E» (Thermo Scientific, Великобритания) толщиной 14 мкм.

Для приготовления парафиновых срезов образцы фиксировали в 10% нейтральном формалине (водный раствор, получаемый при смешивании 1 части 40% водного раствора формальдегида (альдегид муравьиной кислоты) с 9 частями воды) при 37°C в течение 24 часов с последующей промывкой под проточной водой в течение 10 минут. Объем фиксирующей жидкости превосходил объем образцов каудальной доли левого легкого более чем в 20 раз, толщина образца не превышала 0,5 см, иссечение образцов происходило с захватом участка висцеральной плевры. Парафинизацию образцов ткани выполняли ступенчато с предварительной проводкой через ацетон ЧДА (диметилкетон) и ксилол ЧДА (орто-ксилол) и заключением в парафиновую среду (смесь алкановых, изопарафиновых, циклопарафиновых и нафтено-ароматических углеводородов с синтетическими пластификаторами, не содержащая воска, с температурой плавления 52–54°C) с трехкратной заменой при 60°C. Из парафиновых блоков готовили срезы с помощью микротома МЗП-01 Техном (ООО «КБ ТЕХНОМ», Россия), толщиной 5 мкм. Депарафинизацию выполняли путем трехкратного погружения срезов в ксилол с экспозицией в 10 минут и последующей дегидратацией в этаноле возрастающей концентрации. Окраску криостатных и парафиновых срезов проводили гематоксилин-эозином с последующей их дегидратацией в этаноле возрастающей концентрации, просветлением в ксилоле и заключением в монтирующую среду (смесь ксилола, акриловых смол (34,3+/-2,0%)), D-лимонена, пластификатора (дибутиловый эфир фталевой кислоты).

Световую микроскопию гистологических срезов выполняли с помощью микроскопа Olympus BX43 (Япония). Цифровые изображения получали через цифровую CCD-камеру Tucsen TCC 6.1ICE (Китай) в программе ISCapture 3.6 (Китай). В программе Image J (NIH, США) на изображениях срезов проводили морфологическое исследование легочной ткани с морфометрическим анализом. Морфометрический анализ включал измерение размеров альвеолярного входа (РАВ, мкм), площади поперечного сечения альвеол (ППСА, мкм2), максимального и минимального диаметров альвеол (Макс и МинДА, мкм), толщины межальвеолярных перегородок (ТМП, мкм).

Статистический анализ результатов проводили с использованием пакета прикладных программ Statistica, версия 12 (StatSoft, Inc., 2013, США). Все количественные данные представлены в виде M±m. Для выявления статистически значимых межгрупповых различий применяли однофакторный дисперсионный анализ вариаций ANOVA и критерий Тьюки Рost-hoc анализа. Различия принимали статистически значимыми при p<0,05.

3. Основные результаты

Результаты гравиметрического исследования показали, что у животных опытной группы средние значения ЛК и ИВБ увеличивались в 2,3 и 1, 4 раза соответственно, среднее значение СО — снижалось на 27,8% по сравнению с данными контрольной группы (p<0,05) (см. табл. 1).

У животных опытной группы выявлялось значимое увеличение ИОЖ и ПК, средние значения которых были равнозначными. У животных контрольной группы ИОЖ и ПК имели нулевые значения. Таким образом, развитие норэпинефринового ОЛ сопровождается равнозначными повышениями и оводнения и кровенаполнения легких.

Гистоморфологический анализ легочной ткани у животных контрольной группы на криостатных (см. рис. 2, а, в, д, ж) и парафиновых (см. рис. 3, а, в, д, ж) показал, что паренхима легких сохраняла воздушность, альвеолы выстланы эпителием, разделены тонкими межальвеолярными перегородками, содержащими капилляры (см. рис. 2, ж; см. рис. 3, ж).

У животных опытной группы на криостатных (см. рис. 2, б, г, е, з) и парафиновых (см. рис. 3, б, г, е, з) срезах гистоархитектоника легочной ткани гетерогенна с локальными очагами альвеолярного отека и дисателектазами на фоне диффузного отека интерстиция. Наблюдался перибронхиальный и периваскулярный отек (см. рис. 2, 3, б). Венулы расширены и заполнены эритроцитами с частичным их гемолизом (см. рис. 2, г; рис. 3, г), выраженный диапедез эритроцитов на парафиновых срезах (см. рис. 3, е). Интерстиций инфильтрирован нейтрофилами, тучными клетками (см. рис. 2, е; рис. 3, з). Часть альвеол заполнена эозинофильной бесклеточной жидкостью (см. рис. 2, 3, е, з), на криостатных срезах в альвеолах выявлена пенистая жидкость (см. рис. 2, е, з).

На рисунке 4 представлены обозначения вышеперечисленных изменений гистоархитектоники легочной ткани при развитии норэпинефринового отека легких на криостатных срезах и парафиновых срезах. Криостатные срезы рис. 4, а, в, д, ж соответствуют рис. 2, б, г, е, з. Парафиновые срезы рис. 4 б, г, е, з соответствуют рис. 3, б, г, е, з. Пояснения к обозначениям описаны в Примечании к рис. 4.

Таким образом, гистоморфологический анализ позволил установить, что верификация легочного отека возможна при приготовлении срезов и парафиновым методом, и криостатным методом. Но, выявленные структурные изменения являются неоднозначными. Более качественные изменения в интерстиции отображаются на парафиновых срезах, где определяется повышенная клеточная инфильтрация, плазматическое пропитывание, значительное полнокровие капилляров. В то же время вспенивание жидкости в альвеолярном пространстве наблюдалось нами только на криостатных срезах.

Результаты морфометрического исследования показали, что у животных контрольной группы размерные характеристики структур альвеолярного пространства, определяемые на криостатных и парафиновых срезах не различались (см. табл. 2).

Напротив, у животных в опытной группе наблюдались значимые различия. Измерения структур альвеолярного пространства выполнялись в участках легочной ткани с сохраненной воздушностью. Так средняя ППСА была максимальной на криостатных срезах и превышала таковую на парафиновых срезах на 26,6%. Согласно этому средние МаксДА и МинДА криостатных срезов также превышали таковые парафиновых срезов на 17,3% и 23,8% соответственно. При этом форма альвеол на парафиновых срезах имела более вытянутую овальную форму. Средняя ТМП была наибольшей на парафиновых срезах и превышала в 1,6 раза таковую на криостатных срезах. При этом, средний РАВ, определяемый на парафиновых срезах, был в 2,8 раза меньше, чем на криостатных срезах.

Таким образом, морфометрический анализ позволил установить, что размерные параметры структур альвеолярного пространства у интактных животных, определяемые и на криостатных и на парафиновых срезах, являются идентичными, что полностью согласуется и с результатами гистоморфологического анализа. В условиях развившегося норэпинефринового отека легких размерные характеристики структур альвеолярного пространства, определяемые на криостатных срезах, совершенно отличаются от таковых на парафиновых срезах, что также согласуется с результатами гистоморфологического анализа. Безусловно, обе гистологические картины легочного отека — криостатная и парафиновая, позволяют безошибочно, более того, совершенно точно и достоверно верифицировать развитие альвеолярного отека.

4. Обсуждение

Развитие норэпинефринового ОЛ сопровождается повышенными кровенаполнением и оводнением легких, что установлено гравиметрическим исследованием. Результаты гистологического исследования позволили установить, что при данной модели ОЛ у самцов крыс через 50 минут в легких выявляются характерные структурные изменения в виде генерализованного полнокровия сосудов, наличия очаговых дисателектазов, диффузного отека интерстиция и очагового альвеолярного отека, которые выявлены и на парафиновых, и на криостатных срезах. Повышенное кровенаполнение легких с формированием перибронхиального и периваскулярного отека позволяет предположить развитие гемодинамических эффектов норэпинефрина вследствие преимущественной активации α1-адренорецепторов, что обусловлено увеличением системного сосудистого сопротивления и повышением давления заклинивания в легочных капиллярах с развитием венозного застоя в легких [2], [3], [5]. В то же время как влияние норэпинефрина, так и развившийся гемодинамический стресс, инициируют синтез ключевого провоспалительного цитокина интерлейкина-6, хемотаксис и нейтрофильную инфильтрацию легких [11], [13]. Активация цитокинов, воспаление и повышенное капиллярное давление способствуют увеличению проницаемости капилляров и разрушению альвеолярно-капиллярной мембраны. На криостатных и парафиновых срезах в легочных капиллярах выявлен частичный гемолиз эритроцитов, наличие белковой (эозинофильной) жидкости в альвеолах, на криостатных срезах — вспенивание жидкости, на парафиновых срезах выражен диапедез эритроцитов. При обеих методиках приготовления срезов интерстиций легких заполнен мастоцитами и нейтрофилами. Но в то же время на парафиновых срезах выявляется наибольшее увеличение толщины межальвеолярных перегородок с наименьшими размерами альвеолярного входа и альвеол с сохраненной воздушностью по сравнению с таковыми данными, полученными на криостатных срезах.

Известно, что степень гистологического сжатия или расширения ткани может изменяться в зависимости от метода обработки образца [8]. Метод парафиновой заливки может приводить к сжатию легочной ткани [7]. Метод криостатной техники позволяет лучше сохранить исходные объемы и размеры структур альвеолярного пространства, антигенов и нуклеиновых кислот, что делает этот метод незаменимым для иммуногистохимических и молекулярно-биологических исследований [10]. Действительно, при приготовлении срезов криостатным методом мы наблюдали в части альвеол именно пенистую жидкость, что не выявлялось при парафиновом методе. В то же время часть авторов считает, что общее морфологическое качество замороженного среза несколько уступает таковому парафинового среза, однако особенности окрашивания и структура цитозоля являются сопоставимыми [12], что согласуется с нашими данными.

Так, у интактных животных морфометрический анализ изучаемых структур альвеолярного пространства позволил установить отсутствие значимых изменений при приготовлении срезов и парафиновым, и криостатным методами. Но, в условиях развившегося отека легких гистоархитектоника легочной ткани и данные морфометрии, полученные при изучении криосрезов и парафиновых срезов, различались. Возможно, это связано с особенностями приготовления срезов путем парафиновой заливки. Дело в том, что мы так же, как и при парафиновом методе, готовили фиксированные замороженные срезы, поскольку без предварительной фиксации они физически менее стабильны, чем парафиновые [8]. Поэтому методы фиксации образцов ткани были аналогичными при приготовлении срезов обоими методами. Криостатная техника приготовления срезов используется для изучения жировых и липоидых веществ в ткани, которые теряются при пропитывании ткани парафином [4]. По-видимому, выявленные более выраженные изменения легочной ткани, которые включают характерные признаки застойного полнокровия, определяемые на срезах, приготовленных парафиновым методом, связаны с уменьшением содержания липидов, являющихся своего рода барьером для движения воды.

5. Заключение

Развитие норэпинефринового отека легких у крыс сопровождается равнозначными повышениями и оводнения, и кровенаполнения легких, что на криостатных и парафиновых срезах определяется гетерогенностью изменений гистоархитектоники легочной ткани в виде локальных участков альвеолярного отека и дисателектазов на фоне диффузного отека интерстиция при выраженных морфометрических изменениях, выявляемых на парафиновых срезах, где определяется наибольшее увеличение толщины межальвеолярных перегородок с наименьшими размерами альвеолярного входа и альвеол с сохраненной воздушностью.

The additional file for this article can be found as follows: