1. Введение
Интерес к препаратам, содержащим кислоту аскорбиновую, возрастает в связи с ее уникальными свойствами. Кислота аскорбиновая является компонентом эндогенной антиоксидантной системы организма человека и участвует в регуляции окислительных процессов [1], [2]. Антиоксидантная активность кислоты аскорбиновой облегчает течение инфекционных заболеваний, нейтрализуя свободные радикалы и регулируя окислительно-восстановительные процессы. Кислота аскорбиновая активирует процессы фагоцитоза, а также синтез антител, интерферона и С3-компонента комплемента [3]. Вещество принимает активное участие в регуляции иммунологических реакций и повышении устойчивости организма человека к инфекционным заболеваниям.
Aronia melanocarpa L. (арония черноплодная, рябина черноплодная) является перспективным лекарственным растением за счет высокого содержания полезных биологически активных веществ в составе [4]. Свежие плоды аронии активно используются в официнальной медицине и включены Государственную фармакопею (ГФ) XV издания [5]. В связи с тем, что растение активно культивируется, сырьевая база аронии черноплодной на территории Российской Федерации может обеспечивать заготовку не только плодов, а также других частей растения, в частности, побегов и листьев. При успешных исследованиях качественного и количественного состава побегов и листьев Aronia melanocarpa L. и положительных результатах исследований активности данные виды сырья аронии в перспективе могут быть использованы в медицинской и терапевтической практике и впоследствии внедрены в производство лекарственных растительных препаратов (ЛРП) в промышленных масштабах [6]. Таким образом, актуальной задачей является изучение побегов и листьев аронии черноплодной, как нового перспективного источника растительных биологически активных веществ (БАВ) [7].
Целью настоящей работы была сравнительная оценка наличия и количественное определение кислоты аскорбиновой в побегах и листьях аронии черноплодной, а также определение антиоксидантной активности сырья.
2. Объекты и методы
Объектами исследования служили 20 образцов сырья — побеги и листья аронии черноплодной, заготовленные в соответствии с требованиями инструкции по сбору и сушке сырья, а именно — в период цветения (период 1) и после плодоношения (период 2). Сбор сырья проводился в 2023 году. Данные о местах заготовки сырья представлены в таблице 1. Сырье обрабатывали и сушили воздушно-теневым способом.
Места заготовки листьев и побегов аронии черноплодной
| образца | Место заготовки | Период | образца | Место заготовки | Период |
| листья | побеги | ||||
| 1 | п. Лянгасово, садовый участок | 1 | 6 | п. Лянгасово, садовый участок | 1 |
| 1а | 2 | 6а | 2 | ||
| 2 | Удмуртия, с. Факел, садовый участок | 1 | 7 | Удмуртия, с. Факел, садовый участок | 1 |
| 2а | 2 | 7а | 2 | ||
| 3 | Башкирия, г. Учалы, садовый участок | 1 | 8 | Башкирия, г. Учалы, садовый участок | 1 |
| 3а | 2 | 8а | 2 | ||
| 4 | г. Качканар, садовый участок | 1 | 9 | г. Качканар, садовый участок | 1 |
| 4а | 2 | 9а | 2 | ||
| 5 | г. Кыштым, садовый участок | 1 | 10 | г. Кыштым, садовый участок | 1 |
| 5а | 2 | 10а | 2 |
Наличие кислоты аскорбиновой доказали методом тонкослойной хроматографии (ТСХ) по ФС.2.5.0106.18 ГФ РФ XV в системе растворителей этилацетат — уксусная кислота ледяная (80:20) на сорбирующей пластинке «Сорбфил». Для идентификации кислоты аскорбиновой использовали детектор 0,044% раствор 2,6-дихлорфенолиндофенолята натрия [5].
Количественное определение проводили методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) согласно ОФС.1.2.1.2.0005 [8] по методике ФС.2.5.0106 «Шиповника плоды» ГФ ХV [5]. Определение проводили на хроматографе «Миллихром А-02», результаты анализа обрабатывали в программе «Альфа Хром 1.0» на персональных компьютерах с системой Windows 2007. Условия анализа представлены в таблице 2.
Условия хроматографирования
| Колонка | Колонка с обращенно-фазовым сорбентом «Pronto Sil- 120-5-C18 AQ» №0001 (2 мм × 75 мм × 5 мкм) |
| Детектор | Спектрофотометрический |
| Длина волны | 244 нм |
| Скорость потока | 1,0 мл/мин; |
| Температура термостата | С |
| Элюент А | 4 |
| Элюент Б | Ацетонитрил (сорт 0) |
| Полное время цикла | 12 минут |
Определение антиоксидантной активности проводили спектрофотометрическим методом на спектрофотометре СФ-2000 при длине волны 517 нм [9]. Для определения использовали настой и отвар побегов аронии черноплодной, приготовленные согласно ОФС 1.4.1.0018 ГФ РФ ХV [5]. Для исследования готовили водные разведения с концентрациями (40, 80, 120, 160 и 200 мкл в мерной колбе на 100 мл). Оценку антиоксидантной активности сырья проводили по реакции со свободным радикалом 2,2-дифенил-1-пикрилгидразилом (DPPH) (Sigma-Aldrich, США, CAS номер: 1898-66-4). В качестве препаратов сравнения использовали стандартные образцы (СО) рутина, гиперозида. К 1 мл разведения извлечений побегов аронии черноплодной добавляли 3 мл раствора DPPH в 95% спирте этиловом с концентрацией 5 мг/100 мл. В качестве контрольного образца измеряли оптическую плотность 3 мл раствора DPPH в 95% спирте этиловом с концентрацией 5 мг/100 мл и 1 мл воды очищенной. Результаты оценивали в трехкратной повторности в пересчете на сухой остаток.
Значение антиоксидантной активности (поглощение радикала) вычисляли по формуле: % связывания радикала DPPH = [LATEX_FORMULA]\frac{A_{0}-A_{x}}{A_{0}}[/LATEX_FORMULA]× 100, где А0 — оптическая плотность контрольного образца; Ах — оптическая плотность исследуемого образца. Затем определяли величину IC50 — концентрацию вещества, способную связать половинную концентрацию радикала DPPH, мкг/мл. Величина IC50 определяли по прямой, получаемой при построении графиков зависимости ингибирования в процентах от концентрации вещества [9], [10].
3. Основные результаты и их обсуждение
Результаты качественного анализа сырья методом ТСХ свидетельствовали о наличии кислоты аскорбиновой в листьях и побегах аронии черноплодной. На хроматограммах всех исследуемых образцов листьев и побегов аронии черноплодной наблюдали зону абсорбции, характерную кислоте аскорбиновой — зона белого цвета на розовом фоне на уровне зоны абсорбции СО кислоты аскорбиновой.
Результаты количественного определения кислоты аскорбиновой методом ВЭЖХ представлены на рисунках 1, 2.
Содержание кислоты аскорбиновой в листьях аронии черноплодной
По данным, представленным на рисунке 1, видно, что содержание кислоты аскорбиновой в листьях аронии черноплодной составило от 0,09 0,06% до 0,12 0,06%, и от 0,20 0,06% до 0,22 0,08%, заготовленных в период 1 и в период 2, соответственно. Таким образом, содержание кислоты аскорбиновой в листьях аронии черноплодной незначительно увеличивается ко второму периоду заготовки.
Содержание кислоты аскорбиновой в побегах аронии черноплодной
По данным, представленным на рисунке 2, видно, что содержание кислоты аскорбиновой в побегах аронии находится в пределах от 0,21 0,08% до 0,24 0,06%, и от 0,22 0,09% до 0,24 0,08%, заготовленных в период 1 и в период 2, соответственно. Таким образом, содержание кислоты аскорбиновой в побегах аронии черноплодной, заготовленных в разные периоды, практически не изменяется во всех исследуемых образцах.
Результаты определения антиоксидантной активности побегов аронии черноплодной представлены в таблице 3. Результаты эксперимента считали достоверными при р<0,05.
Антиоксидантная активность побегов аронии черноплодной
| Образец | мкг/мл |
| Настой побегов аронии | 7,7 ± 2,8 |
| Отвар побегов аронии | 22,9 ± 13,9 |
| Рутина | 12,6 ± 0,2 |
| Гиперозида | 10,6 ± 0,3 |
В результате отмечено, что настой и отвар побегов аронии черноплодной реагируют с DPPH, что свидетельствует об антиоксидантной активности (табл. 3). По величине IC50 настой и отвар соответствуют значениям известных антиоксидантов рутина и гиперозида.
4. Заключение
В результате проведенного исследования установили, что содержание аскорбиновой кислоты в листьях и побегах аронии черноплодной одинаковое и практически не изменяется в изучаемые периоды заготовки. Период заготовки исследуемых видов сырья аронии не влияет на содержание кислоты аскорбиновой. Настой и отвар побегов аронии черноплодной могут в перспективе являться растительными антиоксидантами.