Истинная полицитемия (ИП) — наиболее распространенная форма Ph-негативных миелопролиферативных новообразований. У 90% больных она ассоциирована с мутацией V617F в гене JAK2, в остальных случаях (2–3%) обнаруживаются мутации в 12 экзоне этого гена. Патогенез ИП определяется гиперактивацией JAK‑STAT сигнального каскада; чаще всего это состояние провоцируется мутацией V617F, локализованной в 14‑м экзоне гена JAK2. В настоящее время насчитывается более 90 мутаций, находящихся в 12 экзоне. Из них наиболее часто встречающиеся — F537‑K539delinsL, H538QK539L, K539L, N542‑E543del, R541‑E543delinsK и H538‑K539delinsL. Для выявления соматических мутаций в 12‑м экзоне гена JAK2 применяют ряд молекулярно‑генетических методик. Среди них — секвенирование ДНК, фрагментный анализ, а также различные модификации ПЦР в реальном времени, включая аллель‑специфичную ПЦР и методы, основанные на анализе кривых плавления для детекции мутаций. Однако ни один из рассмотренных методов не способен одновременно и однозначно детектировать все возможные варианты соматических мутаций. Это обусловлено как их значительным разнообразием, так и тем, что уровень аллельной нагрузки мутантных клеток в крови пациента нередко оказывается ниже порога чувствительности применяемых методик. По этой причине анализ мутаций в 12‑м экзоне гена JAK2 пока не вошёл в рутинную практику клинико‑диагностических лабораторий.Выявление мутаций в 12‑м экзоне гена JAK2 — значимый диагностический инструмент в работе с пациентами, страдающими миелопролиферативными новообразованиями. Эти генетические изменения служат одним из ключевых критериев диагностики таких патологий, как ИП, эссенциальная тромбоцитемия (ЭТ) и первичный миелофиброз (ПМФ).
1. Введение
Одной из наиболее распространенных форм Ph-негативных миелопролиферативных новообразований, согласно классификации ВОЗ 2022 г, является ИП [1]. Основным критерием необходимым для постановки диагноза является молекулярно-генетическое исследование на наличие мутации V617F гена JAK2 или мутаций в 12 экзоне гена JAK2 [2], [3].
Большинство пациентов с установленным диагнозом истинной полицитемии (ИП) имеют мутацию V617F в гене JAK2 — её выявляют примерно у 90% больных. Для 2–3% пациентов, у которых мутация V617F не обнаружена (V617F‑отрицательные случаи), характерны другие генетические изменения в гене JAK2. Эти мутации локализуются в онкоассоциированной области 12‑го экзона и включают микроделеции, микроинсерции и точечные мутации, затрагивающие аминокислотные остатки в позициях 532-547 белка JAK2 [4].
Цель работы — систематизировать данные о клинической значимости мутаций в 12 экзоне гена JAK2 и методах молекулярно-генетической диагностики.
2. Основная часть
В основе патогенеза ИП лежит неконтролируемая активация сигнального пути JAK‑STAT, которая в большинстве случаев вызвана мутацией V617F в 14‑м экзоне гена JAK2 [5]. JAK2 связывается с цитоплазматическими участками различных рецепторов ключевых гемопоэтических цитокинов, таких как эритропоэтин (ЭПО), тромбопоэтин (ТРО) и гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (Г-КСФ). Конститутивная активация JAK2 посредством точечной мутации или белка слияния приводит к активации пути JAK-STAT. Мутация JAK2 V617F в домене JH2 нарушает ингибирующую функцию псевдокиназы JH2, что приводит к конститутивной активности фосфорилирования тирозина JH1, которая способствует гиперчувствительности к цитокинам [6]. Экзон 12 находится в области между доменами SH2 и JH2 гена JAK2 и кодирует аминокислоты с 505 по 547. Среди них мутации были выявлены в 533–547 кодонах [7]. Частота встречаемости таких мутаций среди больных ИП составляет около 5% для европейской популяции [8] и около 10–20% для азиатской популяции [9], [10].
Мутации 12 экзона гена JAK2 при ИП ассоциируются с более ранним возрастом дебюта заболевания, высоким уровнем гемоглобина, нормальными показателями лейкоцитов и тромбоцитов, а также субнормальным уровнем ЭПО сыворотки [11]. Изолированный эритроцитоз нередко является ведущим симптомом при мутации в 12‑м экзоне. Однако по риску тромбозов и вторичного миелофиброза группы не различаются [12], [13].
С 2007 года в 12‑м экзоне гена JAK2 зарегистрировано свыше 90 мутаций. Хотя они обнаруживаются с различной частотой, все они важны для клинической верификации ИП [9], [14]. В 2009 году Ma W. et al. с соавторами выявили новые мутации в экзонах 12, 13, 14 и 15, а именно T514M, N533Y, L545V, F547L в экзоне 12; R564L, R564Q, V567A, G571S, G571R, L579F, H587N, S591L и F557L (со сдвигом рамки считывания и ранней терминацией) в экзоне 13; H606Q, H608Y, V617I, C618R в экзоне 14; и L624P, I645V в экзоне 15 с помощью метода ОТ-ПЦР и прямого секвенирования РНК [15].
Мутации 12 экзона встречаются исключительно при ИП, и не встречаются при первичном миелофиброзе, в отличие от JAK2 V617F, что подтверждено различными исследованиями. Так, в 2012 году, группа исследователей под руководством Wang J.Y., проводя анализ мутационного статуса 12 экзона гена JAK2 с помощью прямого секвенирования у пациентов с миелопролиферативными заболеваниями, выявила, что у пациентов с ЭТ, ПМФ, неклассифицированными миелопролиферативными новообразованиями (МПН-Н) — мутации 12 экзона гена JAK2 не обнаружена. Из 13 пациентов с ИП, не имеющих мутацию V617F, у 2 пациентов (15,4%) была обнаружена N542_E543del [16].
В клинической практике наиболее часто верифицируются следующие мутации - F537‑K539delinsL, H538QK539L, K539L, N542‑E543del, R541‑E543delinsK и H538‑K539delinsL. Мутации V536‑I546dup11 и F537‑I546dup10 + F547L выявляются значительно реже, при этом их обнаружение возможно, как при семейных, так и при спорадических вариантах заболевания [11], [12]. В исследовании Pietrа D. (2008) мутации N542‑E543del, F537‑K539delinsL и E543‑D544del были выявлены у 15 из 26 пациентов со спорадическими случаями ИП и у 2 из 11 пациентов с семейными формами заболевания [17]. В работе Park C.H. и соавторов анализ ДНК 42 пациентов позволил обнаружить мутации в 12‑м экзоне гена JAK2 лишь у 5 человек [18].
Согласно национальным клиническим рекомендациям, анализ мутаций в 12 экзоне гена JAK2 является одним из больших критериев при постановке диагноза «истинная полицетемия» и проводится только в период первичной диагностики при отсутствии мутации V617F [2].
Диагностика соматических мутаций в области 12 экзона гена JAK2 проводится с использованием различных молекулярно-генетических методов, таких как - секвенирование ДНК, фрагментный анализ, а также различные модификации ПЦР в реальном времени: аллель-специфичная ПЦР, методы детекции мутаций на основании анализа кривых плавления и др. [19].
В 2008 году Jones A.V. et al. представили метод выявления делеций в 12 экзоне с помощью анализа плавления высокого разрешения (HRM), который оказался более чувствительным, чем прямое секвенирование, при этом полученные данные предполагали нагрузку не ниже 20% [20]. В 2010 г. Laughlin T.S. c коллегами опубликовали исследование по разработке теста для выявления мутации в 12 экзоне с аналитической чувствительностью 0,1%. Анализ представлял собой ПЦР с последующим секвенированием с помощью капиллярного электрофореза на генетическом анализаторе ABI Prism 3100. Для повышения аналитической чувствительности использовался блокирующий праймер, состоящий из LNA-нуклеотидов и имеющий на 3’ конце C3 линкер [21]. Kjaer L. et al. в 2012 году был разработан высокочувствительный ПЦР-анализ для оценки аллельной нагрузки мутаций экзона 12. Метод позволяет контролировать мутационный статус даже при очень низкой аллельной нагрузке. Также были разработаны различные анализы HRM с чувствительностью 1-20% в зависимости от анализа и мутации [22].
Существуют исследования, в которых проводится анализ на мутации в 12 экзоне гена JAK2 c помощью двух различных методов. В 2013 году Furtado L.V. et al. представили мультиплексный метод анализа фрагментов для комплексного выявления мутаций экзона 12 JAK2 в клинических условиях. Тест включает в себя анализ длины фрагментов для выявления делеционных и дупликационных мутаций и аллель-специфическую ПЦР для выявления замены K539L в одной пробирке. Такой подход демонстрирует высокую аналитическую чувствительность (от 1% до 2%), которая превосходит прямое секвенирование и HRM, а также возможность выявлять широкий спектр мутаций 12 экзона [23].
Maslah N. et al. (2019) провели сравнительное исследование по обнаружению мутаций в 12 экзоне гена JAK2 c помощью NGS и аллель-специфической количественной ПЦР. В результате было выявлено, что NGS является надежным методом, высоко коррелирующим с кПЦР, хотя и менее чувствительным, но дающим возможность идентифицировать другие варианты JAK2, потенциально влияющие на возникновение или развитие заболевания. Среди образцов ДНК 427 пациентов, проанализированных с помощью кПЦР и NGS, авторы обнаружили высокую корреляцию между обоими методами, в том случае, когда аллельная нагрузка превышала 2% [24].
Согласно результатам исследования, выполненного Субботиной Т.Н. и коллективом авторов, при скрининге инсерционно‑делеционных мутаций в 12‑м экзоне гена JAK2 установлены следующие показатели чувствительности — для гетеродуплексного анализа с электрофорезом в полиакриламидном геле — от 3,13 до 6,25% доли мутантного аллеля в образце; для HRM‑анализа — от 6,25 до 12,5%. На основании полученных данных оба метода рекомендованы в качестве инструментов предварительного скрининга мутаций указанного типа [19].
Следует отметить, что ни один из представленных выше методов диагностики не позволяет в полном объёме и с однозначной достоверностью идентифицировать весь спектр возможных соматических мутаций. Данное ограничение связано с двумя ключевыми факторами — высокой вариативностью мутационных событий, а также тем, что уровень аллельной нагрузки соматическими мутациями в крови пациента зачастую оказывается ниже уровня чувствительности предложенного метода. В результате исследование мутаций в 12‑м экзоне гена JAK2 до настоящего времени не получило широкого распространения в рутинной работе клинико‑диагностических лабораторий.
На сегодняшний день на рынке представлены следующие наборы для выявления мутаций:
1. Набор ООО «ГеноТехнология», предназначенный для количественного выявления 3 делеций (p.N542_E543del, p.R541_E543del,p.R541_E543delinsK) методом ПЦР-РВ.
2. LightMix® Kit JAK2 Exon 12 Mutation Screening идентифицирует мутации 539Leu, 538Q-539L, del537-539inL, E543-D544del и N542-E543del с помощью анализа кривых плавления Roche LightCycler ® 2.0 или анализатора cobas z 480.
3. HemeScreen JAK2 Exon 12 Kit предназначен для обнаружения мутаций гена JAK2 Exon 12 с помощью методов HRM (предел обнаружения 5%).
4. Набор JAK2 GENEMAP JAK-2 Exon12 GeneMAP™ предназначен для выявления и количественной оценки 10 мутаций (N542-E543del, E543-D544del, K539L, H538-K539delinsL, I540-E543delinsMK, H538QK539L, R541-E543delinsK, F537-K539delinsL, V536-I546dup11, F537-I540delinsLV) в экзоне 12 гена JAK2 с помощью ДНК, выделенной из периферической крови. Предел обнаружения составляет 0,5%, с достоверностью 95%.
Все представленные выше наборы не имеют регистрационного удостоверения в РФ.
3. Заключение
Выявление мутаций в 12‑м экзоне гена JAK2 — значимый диагностический инструмент в работе с пациентами, страдающими миелопролиферативными заболеваниями. Эти генетические изменения служат одним из ключевых критериев диагностики таких патологий, как ИП, ЭТ и ПМФ.
Обнаружение мутаций позволяет подтвердить диагноз у пациентов с характерными клиническими проявлениями или отклонениями в анализах крови (например, при повышенном уровне эритроцитов, тромбоцитов или лейкоцитов), провести дифференциальную диагностику, отделив миелопролиферативные заболевания от состояний со схожей симптоматикой (в частности, от реактивных изменений крови). Например, при подозрении на ИП выявление мутации помогает исключить вторичный эритроцитоз, который может развиваться на фоне гипоксии, онкологических заболеваний и иных причин.
Наличие мутации в 12‑м экзоне JAK2 способно влиять на клиническое течение заболевания и определять тактику лечения. В частности, такие мутации часто ассоциируются с истинной полицитемией при субнормальном уровне ЭПО и более ранним началом заболевания. Хотя риски тромбозов и развития миелофиброза сопоставимы при мутациях в 12 и 14 экзонах JAK2, точная идентификация типа мутации критически важна для персонализации терапии.
Таким образом, анализ мутаций в 12 экзоне гена JAK2 представляет собой неотъемлемый элемент комплексной оценки пациентов с миелопролиферативными заболеваниями. Он обеспечивает своевременную и точную диагностику, корректную стратификацию риска, разработку индивидуализированной стратегии лечения.
The additional file for this article can be found as follows:
Further description of analytic pipeline and patient demographic information. DOI: