1. Введение

Чума, вызываемая Yersinia pestis, остаётся одной из наиболее опасных природно-очаговых зоонозных инфекций, обладающих высоким эпидемиологическим и биотеррористическим потенциалом [1], [2]. В международных медико-санитарных правилах (2005 г.) чума включена в список инфекционных болезней, способных вызывать чрезвычайные ситуации общественного здравоохранения, имеющие международное значение. Несмотря на достижения в области эпиднадзора и развития молекулярно-генетических методов диагностики, исследование биологических и генетических свойств циркулирующих штаммов чумного микроба остаётся важной задачей [3], [4].

В настоящее время эпидемиологическая ситуация по чуме в мире остается напряженной [5], причём без тенденции к снижению. Эпидемиологические проявления чумы в 2014–2024 гг. зарегистрированы на территории 10 государств. Общее число случаев заболевания составило 5514, из них летальных — 605 (показатель летальности — 11,1%) [6], [7], [8]. Наиболее сложная эпидемиологическая ситуация за указанный период складывалась в Республике Мадагаскар 3457 (373) и Демократической Республике Конго 1352 (76), которые составляют 87,2% от всех зарегистрированных случаев [9], [10].

На территории Казахстана различные типы природных очагов чумы (пустынный, степной, высокогорный и смешанный) занимают 1083,9 тыс. кв. км, что составляет около 40% территории, в том числе трансграничные высокогорные очаги чумы (Киргизия, Монголия, Китай, Россия), где в прошлом неоднократно имели место вспышки заболевания чумой среди населения [11], [12], [13], [14]. Регистрация последних случаев заболеваний людей чумной инфекцией в Казахстане было в 2003 г. [11], однако ежегодные регистрации эпизоотий диких животных представляют биологическую угрозу [15], [16], [17].

На территории Казахстана располагается несколько активных пустынных очагов чумы, требующих регулярного эпизоотологического мониторинга [2], [18]. В последние годы особое внимание уделяется работам отечественных исследователей, которые внесли значительный вклад в изучение природных очагов, картирование ареалов, определение эпидемиологических рисков и генетическую характеристику изолятов Y. pestis [19], [20], [21], [22].

Фенотипическая характеристика штаммов циркулирующих в природных очагах чумы Казахстана, включающая анализ морфологии, роста на питательных средах, лизиса фагами, в том числе способности продукции факторов вирулентности, позволяет оценивать их эпизоотологическое и эпидемиологическое значение для совершенствования профилактических и противоэпидемических мероприятий [23], [24].

Среди молекулярно-генетических подходов особое место занимает метод мультилокусного вариабельного анализа тандемных повторов (MLVA), который успешно применяется для типирования и анализа филогенетических связей между штаммами чумного микроба. С использованием этого метода в ряде работ была установлена внутривидовая структура Y. pestis, циркулирующей в Казахстане, а также её связи с глобальными генетическими линиями. Использование программного обеспечения PAUP и FigTree, а также алгоритма UPGMA, обеспечивает наглядную визуализацию эволюционных отношений между штаммами [19], [25], [26].

Настоящее исследование направлено на выделение, фенотипирование и генотипирование штаммов Y. pestis, полученных в рамках эпизоотологического мониторинга в 17 пустынных природных очагах Казахстана. Полученные результаты позволят расширить представления о структуре популяции чумного микроба и оценить её эпидемиологическое значение.

2. Методы и принципы исследования

2.1. Фенотипические свойства

Для изучения фенотипических свойств штаммов чумного микроба использованы бактериологический, серологический и молекулярно-генетические методы исследования. Определение фенотипических свойств произведены по следующим тестам: морфология, лизис фагов, пестициногенность, характер роста на питательных средах, тесты с фенилаланином, метионином, треонином; ферментация глицерина, отношение к глюкозе, манниту, мальтозе, арабинозе, сахарозе и лактозе [27], [28]. Таксономическое положение всех штаммов были идентифицированы на аппарате Biomerieux Vitek 2 Compact 30 Microbiology Analyzer. USA» (табл. 1). Биохимические показатели Yersinia pestis штаммов чумы отработанные на аппарате VITEK 2 Systems: 2024.07.01. Вероятность 96,0%. Достоверность: отличная идентификация. Карта GN 00001B1B42DB.

В качестве референтных образцов были использованы штаммы: Yersinia pestis EV, Y. pseudotuberculosis 2841.

2.2. Генотипические свойства

Идентификация штаммов проводилась с помощью метода полимеразной цепной реакции с применением ПЦР тест-систем разных производителей: «Plague qPCR», Казахстан и АмплиСенс, Россия. Для экстракции ДНК чумного микроба был использован набор «РИБО-преп» Кат. № К2-9-Et-100, Россия.

Филогенетический анализ проводился с помощью программы PAUP 4.0 (paup.csit.fsu.edu). Для иерархической кластеризации был использован алгоритм UPGMA (Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean — метод невзвешенного попарного среднего). Окончательное оформление филогенетического дерева проводилась на графическом редакторе FigTree v.1.4.4 (tree.bio.ed.ac.uk).

Выделение ДНК. Взвеси исследуемых штаммов Y. pestis подвергались температурному воздействию (100 °С) в течение 10 минут. Далее взвеси центрифугировались 2 минуты при 12 000 об/мин. Супернатант использовался для выделения ДНК. Экстракция ДНК проводили с помощью набора для выделения ДНК: «Комплект реагентов для экстракции РНК/ДНК «АмплиПрайм РИБО-преп, Россия»». В промаркированные пробирки внесли по 300 мкл раствора для лизиса, затем в пробирки с лизирующим раствором используя наконечники с аэрозольным фильтром вносили по 100 мкл убитых взвесей штаммов чумного микроба. Содержимое пробирок тщательно перемешали на вортексе, процентрифугировали в течение 5 секунд для осаждения капель и подогрели при 650С в течение 5 минут. Затем добавили в пробирки по 400 мкл раствора для преципитации, перемешали на вортексе, процентрифугировали в течение 5 минут при 13 тыс об/мин. После этого, осторожно, не задевая осадок, с помощью отдельного наконечника отобрали надосадочную жидкость. В пробирку с осадком добавили по 500 мкл раствора для отмывки 3, осторожно промыли осадок, переворачивая пробирки 3-5 раз, процентрифугировали при 13 тыс об/мин в течение 2 минут, затем, осторожно, не захватывая осадок, отобрали надосадочную жидкость с помощью отдельного наконечника. Добавили в пробирки с осадком по 200 мкл раствора для отмывки 4, осторожно промыли осадок, переворачивая пробирки 3–5 раз, процентрифугировали при 13 тыс об/мин в течение 2 минут, также осторожно, не захватывая осадок, отобрали и отбросили надосадочную жидкость с помощью отдельного наконечника. Затем поместили пробирки с осадком в термостат при температуре 65 °C на 5 минут для подсушивания осадка, для этого крышки пробирок оставили открытыми. Добавили в пробирки по 90 мкл РНК-буфера. Перемешали на вортексе. Поместили в термостат при 65 °C на 5 минут, периодически встряхивая на вортексе. Процентрифугировали при 13 тыс об/мин в течение 1 минуты и отобрали надосадочную жидкость, которая содержит очищенную ДНК и переносили в заранее промаркированные пробирки. Проведена амплификация VNTR локусов и анализ методом гель-электерофореза.

Для генетического анализа области пигментации Y. pestis были использованы праймеры ripA-m3-f/ ripA-m3-r, кодирующий 4-гидроксибутират кофермента A трансферазы. Генотипирование исследуемых изолятов проводилось на основе структуры VNTR локусов методом мультилокусного VNTR анализа (Multiple Loci VNTR Analysis, MLVA). Штаммы изучены методом MLVA по 18 VNTR локусам. При этом вначале проводился анализ по 7 наиболее вариабельным VNTR локусам (MLVA-7), а затем — по 11 локусам (MLVA-18). В качестве референтных образцов были использованы штаммы Y. pseudotuberculosis 2841 и ДНК четырех изученных штаммов Y. pestis, представляющих основные биовары чумного микроба: Pestoides F (биовар Microtus/Antiqua), Nepal516 (биовар Antiqua), KIM10+ (биовар Mediaevalis) и CO92 (биовар Orientalis). При филогенетическом анализе использовались данные GenBank NCBI (National Center for Biotechnology Information). Идентификация штаммов проводилась с помощью метода полимеразной цепной реакции с применением ПЦР тест-систем разных производителей: «Plague qPCR», Казахстан и АмплиСенс, Россия. Филогенетический анализ проводился с помощью программы PAUP 4.0 (paup.csit.fsu.edu). Для иерархической кластеризации был использован алгоритм UPGMA (Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean — метод невзвешенного попарного среднего). Окончательное оформление филогенетического дерева проводилось на графическом редакторе FigTree v.1.4.4 (tree.bio.ed.ac.uk) [29], [30], [31], [32].

2.3. Лабораторные животные

Вирулентность штаммов чумы, как правило, изучается на лабораторных мышах, реже на морских свинках [27], [28]. В исследовании использовали самцов мышей линий BALB/c и C57BL/6, возрастом 2–3 месяца и массой 22 г, ± 10% которые содержались в индивидуально вентилируемых клетках (ИВК) с HEPA-фильтром (Allentown, USA) на сертифицированных автоклавируемых кормах и подстиле SSNIFF (Spezialdaten GmbH, Германия). Температура окружающей среды составляла (23 ± 2оС), влажность (50 ± 10%) и циклом день/ночь (10:14). Вода и корм ad libitum. Животных взвешивали с помощью весов Adventurer RV 1502 (Ohaus, Китай).

2.4. Заражение мышей

Мышей заражали инокулятом Y. pestis в объеме 0,5 мл приготовленного на 0,9% стерильном физиологическом растворе хлористого натрия внутрибрюшинным способом. Количество клеток бактерий определяли по оптическому отраслевому стандарту мутности (ОСО) 10 ЕД. Заражающие дозы были 102 и 103 клеток Y. pestis на животное. 

2.5. Биологическая безопасность

Все работы проводили в сертифицированных по ISO 35001 лабораториях ABSL3 в Центральной Референтной Лаборатории. Работы проводились в шкафу биологической безопасности SG404, класс II, тип А2 (Baker, США).

2.6. Биоэтика

Протокол исследований был утвержден Институциональным комитетом по содержанию и использованию лабораторных животных ННЦООИ, № 3, 30.05.24.

2.7. Изучение чувствительности и резистентности к антибактериальным препаратам

В скрининг чувствительности и резистентности к антибактериальным препаратам (АБП) включены штаммы Y. pestis (n=35), изолированные от диких животных в 2024 г. из территории трех природных очагах чумы Казахстана. Были использованы АБП в дисках (n=72) и стрипах (n=50) по основным группам (n=25). Использованы стандартные диско-диффузионный метод и «Е-тест» для определения чувствительности, для выявления генов резистентности БЛРС фенотипический метод [33], [34], [35] и для скрининга генов резистентности к гликопептидам и бета-лактамазам ПЦР реального времени [36], [37]. Также использованы контрольные эталонные штаммы: Y. pestis EV НИИЭГ, Y. pseudotuberculosis R-2841, Escherichia coli ATCC 25922, Staphylococcus aureus АТСС 372, Pseudomonas aeruginosa ATCC 377, Klebsiella pneumoniae АТСС 70060. Штаммы культивировали на агар Мюллера-Хинтона (рН 7,3 ± 0,2) и агаре Хоттингера (рН 7,2 ± 0,1), при температуре 28-37 °С.

При определении чувствительности возбудителя чумы к АБП использовали суспензию микробных клеток из суточной агаровой культуры в 0,85% изотоническом растворе хлорида натрия, стандартизированную по отраслевому стандарту мутности по Mcfarland standart set (R092-1NO LOT0000633797; 2026-02. HiMedia Laboratories Pvt. Ltd. Maharashtra, INDIA) в двух показателях R092А и R092В. Через 10–15 мин накладывают диски, посевы инкубировали при 28°С. Предварительный учет проводили через 24 ч, окончательный — через 48 ч. В качестве контроля использовали эталонные штаммы и и чашки со стерильнми дисками. Диаметры зон задержки роста культуры вокруг дисков, измеряли с точностью до 1 мм специальной линейкой-лекало фирмы HiMedia Laboratories Pvt. Ltd., Индия.

Для определения генов вирулентности в ПЦР РВ выделение ДНК проводилось с помощью коммерческого набора «РеалБест УниМаг» серии С-8883, срок годности 22.07.2025 г., производства «Вектор БЕСТ», Россия и набор «РИБО-преп» Кат. № К2-9-Et-100, Россия, для роботизированной системы выделения ДНК/РНК. В поисках детерминанта антибиотикорезистентности в геномах лизатов использовался набор реагентов для выявления генов резистентности к гликопептидным и бета-лактамным антибиотикам у бактерий van A\B (ванкомицину, тейкопланину); mec A (метициллину, оксациллину); tem, ctx-М-1, shv (пенициллинам и цефалоспоринам); oxa-40-like, oxa-48-like, оxa-23-like, oxa-51-like, imp, kpc, ges, ndm, vim (карбапенемам) фирмы «BacResista GLA Real-Time PCR Detection Kit» (DNA-Technology LLC, Moscow, Russia).

3. Основные результаты

3.1. Изучение фенотипических свойств Yersinia pestis

Микробиологический мониторинг свойств штаммов чумного микроба, изолированных в природных очагах Казахстана — актуальная часть эпидемического мониторинга. Следует учитывать и разную вирулентность и, следовательно, эпидемическую значимость штаммов в мониторинге природных очагов и уточнении ареалов распространения штаммов Yersinia pestis.

Всего было изучено 35 штаммов изолированных в пустынных природных очагов чумы Казахстана в 2024 году, в том числе от носителей было исследовано 20 штаммов (19 — от больших песчанок и 1 — от полуденной песчанки и от переносчиков исследовано 15 штаммов: Xenopsylla gerbilli — 6 экз., Coptopsylla lamellifer — 1 экз., X. skrjabini — 4 экз., Neopsylla laeviceps — 4 экз). Сведения об изученных штаммах чумного микроба представлены в таблице 2.

На рисунке 1 представлено выделение штаммов чумного микроба (Yersinia pestis) в разрезе областей Республики Казахстан: 20 – в Актюбинской, 12 – в Жетысуской, 2 – в Кызылординской и 1 – в Алматинской областях 

Изучение фенотипических свойств Y. pestis

В результате изучения культур чумного микроба установлено, что большинство выделенных штаммов являются типичными представителями для Центрально-Азиатского пустынного очага чумы: имеют типичную морфологию, лизируются чумным Покровской, псевдотуберкулезным, Л-413 «С» бактериофагами; пестициногенны и не чувствительны к пестицину I, растут при 28ºС на синтетической питательной среде с цистеином, фенилаланином, метионином, треонином; ферментируют глицерин, глюкозу, манит, мальтозу, арабинозу, не разлагают сахарозу и лактозу. Все штаммы состоят из клеток, зависимых от ионов кальция при 37º С (Са– клеток 75-100%); для всех штаммов не была характерна реакция денитрификации. Все штаммы отнесены к средневековому биовару возбудителя чумы.

Однако часть штаммов отличались от типичных по некоторым свойствам. Пять штаммов из Илийского межгорного очага имели сниженное количество FI.

У чумного микроба известны факторы патогенности: Pgm+ (признак пигментации) — поглощение и накопление экзогенного гемина, как источника железа; Lcr+ (VWa+) — проявление «низкого кальциевого ответа», необходимого для оптимальной продукции V и W антигена и белков внешней мембраны (YOPs); Tox+ — продукция «мышиного токсина»; Fra+ — продукция капсульного антигена — фракции 1; Pst+ — сочетанный синтез фибринолизина, коагулазы и пестицина (Pst, Fib, Coa); Pur+ — способность синтезировать эндогенные пурины; рН6 антиген; каталаза; ауксотрофность; денитрифицирующая активность; фосфолипаза Д; гемолитическая активность; липополисахариды; резистентность сыворотки и другие.

Детерминанты патогенности Y. pestis подразделяются на обязательные (основные) — расположенные на плазмиде кальцийзависимости pCad и pgm- области хромосомы Y. pestis; и необязательные (второстепенные) — расположены в плазмидах pPst и pFra [25], [38].

Изучена способность к пигментообразованию (Рgm+) на среде с гемином. Известно, что признак пигментации в высокой степени коррелирует с вирулентностью. В популяции вирулентных штаммов Рgm+ клетки в количественном отношении доминируют. Утрата признака пигментации сопровождается, как правило, резким ослаблением вирулентности. Подавляющее большинство штаммов, выделяемых на территории Центральной Азии и Казахстана, обладает признаком пигментации. Вместе с тем описаны редкие случаи выделения культур, полностью состоящих из Рgm– клеток к пигментообразованию.

Все изученные штаммы содержали от 67 до 90% Рgm+ клеток. Способность была изучена на среде с гемином и на конго красном агаре. Были получены сопоставимые результаты.

Признак отношения к кальцию тесно связан с вирулентностью возбудителя чумы. Штаммы содержали от 65 до 80% кальцийзависимых (Са –) клеток.

В целом, фенотипические свойства штаммов Y. pestis, были типичными кроме 5 штаммов из Илийского межгорного очага чумы со сниженным количеством фракции 1 (FI).

Постоянный мониторинг чувствительности к антимикробным агентам штаммов Y. pestis важен из-за возможности возникновения генов антибиотикорезистентности в бактериальных плазмидах [39].

Анализ фенотипической чувствительности Y. pestis (n=35) in vitro показал высокую чувствительность к группам β-лактамы, тетрациклины, аминогликозиды, амфениколы, гликопептиды, линкозамиды, хинолоны (100,0%), чувствительны к антибиотикам других разных групп (97,5%) и показали низкую активность к macrolides (0,0-58,0%), что доказывает неактивность данной группы к «гр–» бактериям, в том числе к роду Enterobacteriaceae spp.

Установлены пределы чувствительности и подавляющие концентрации, где были составлены и оптимизированы антибиотикограмма для 35 штаммов Y. pestis. Результаты исследования стандартных методов «Диско-диффузный» и «Е-тест» с указанием пределы диапазонов значений минимальной подавляющей концентрации АБП и диаметров зон ингибиции роста. Наиболее активными антибиотиками были группа β-lactames, в том числе цефепим, цефтриаксон и ципрофлоксацин, за ними следовали офлоксацин и ампициллин. Средства, традиционно используемые для лечения чумы (стрептомицин, тетрациклин и хлорамфеникол), были менее активны чем β-лактамы. Слабую активность против всех 75 штаммов показали триметоприм — 15,7 мм (12–22 мм) и рифампицин — 18,2 мм (15–22 мм). Результаты исследования по чувствительности и резистентности были подтверждены стандартным методом «Е-тест», в стрипах с указаниями минимальной ингибирующей концентрации.

Результаты молекулярно-гентических исследований в поисках детерминанта антибиотикорезистентности в геномах для выявления генов резистентности к гликопептидным и бета-лактамным антибиотикам van A\B (ванкомицину, тейкопланину), mec A (метициллину, оксациллину), tem, ctx-М-1, shv (пенициллинам и цефалоспоринам), oxa-40-like, oxa-48-like, оxa-23-like, oxa-51-like, imp, kpc, ges, ndm, vim (карбапенемам) подтвердили отсутствие генов у 35 изолятов Y. pestis. Выявлены гены van A/B (9,166) детерминанта FAM и tem (34,60) детерминанта CY5 у E. coli и соотвественно у P. aeruginosa 8,954 и 24,85.

Таким образом, результаты исследования продемонстрировало отсутствие у 35 изолятов Y. pestis к 72 антибактериальным препаратам по следующим основным группам: бета-лактамазы расширенного спектра — БЛРС (пенициллины, цефалоспорины, карбапенемы), монобактамы, макролиды, тетрациклины, аминогликозиды, амфениколы, гликопептидные, линкозамиды, фторхинолоны и антибиотики разных групп. 

3.3. Изучение вирулентных свойств Yersinia pestis

Одной из основных характеристик патогенности микроорганизма является вирулентность, которая определяется по значению средней смертельной дозы (ЛД50) в остром эксперименте. Для расчета ЛД50 используют самые разнообразные подходы, например, метод Рида и Менча, арифметический метод и другие. Высокая вирулентность затрудняет использование этих методов из-за неравномерной шкалы между долей и шагом дозировки. Так, инфекционная доза Yersinia pestis экстремально низкая и составляет всего несколько клеток. Некоторые авторы и вовсе отталкиваются от значения ЛД50 для чумы в 500 КОЕ. Однако зависимость вирулентности от свойств микроба, пути заражения, способов приготовления инокулята, иммунного статуса и вида макроорганизма накладывает серьёзные ограничения на использование теста ЛД50. Также известно, что некоторые инбредные линии мышей проявляют различную чувствительность к Y. pestis. Поэтому, мы отказались от расчета ЛД50, где используется около 20 животных в пользу оценочного метода по следующей схеме оценки вирулентности штаммов Y. pestis на мышах (рисунок 2).

В этой процедуре используется всего 6 особей, что также обеспечивает соблюдение принципов 3Rs. В силу высокой вирулентности, ожидается, что смерть животных будет наблюдаться даже при низких дозах, 100 и менее микробных тел. При этом учитывали также время наступления смерти животных, которое хорошо известно для чумы 4–6 день после заражения.

Лабораторные животные. Вирулентность штаммов чумы, как правило, изучается на лабораторных мышах, реже на морских свинках.

В исследовании использовали самцов мышей линий BALB/c и C57BL/6, возрастом 2–3 месяца и массой 22 г, ± 10% которые содержались в индивидуально вентилируемых клетках (ИВК) с HEPA-фильтром (Allentown, USA) на сертифицированных автоклавируемых кормах и подстиле SSNIFF (Spezialdaten GmbH, Германия). Температура окружающей среды составляла (23 ± 2оС), влажность (50 ± 10%) и циклом день/ночь (10:14). Вода и корм ad libitum. Животных взвешивали с помощью весов Adventurer RV 1502 (Ohaus, Китай).

Заражение мышей. Мышей заражали инокулятом Y. pestis в объеме 0,5 мл приготовленного на 0,9% стерильном физиологическом растворе хлористого натрия внутрибрюшинным способом. Количество клеток бактерий определяли по оптическому отраслевому стандарту мутности (ОСО) 10 ЕД. Заражающие дозы были 102 и 103 клеток Y. pestis на животное.

Биологическая безопасность. Все работы проводили в сертифицированных по ISO 35001 лабораториях ABSL3 в Центральной Референтной Лаборатории. Работы проводились в шкафу биологической безопасности SG404, класс II, тип А2 (Baker, США).

Биоэтика. Протокол исследований был утвержден Институциональным комитетом по содержанию и использованию лабораторных животных ННЦООИ, № 3, 30.05.24.

Результаты. Исследование вирулентности проводили оценочным методом по уровню смертности и средней продолжительности жизни. Высокая вирулентность штаммов Y. pestis не позволяет правильно использовать классические методы расчета ЛД50. Поэтому был применен оценочный способ, который основан на учете смертности мышей от пороговых доз 102 и 103 микробных клеток. В тех случаях, когда все животные умирают при минимальной дозе, то изучаемый штамм относится к высоковирулентным. Рассчитанная медиана выживаемости мышей линий BALB/c и C57BL/6 для изученных штаммов составила от 3 до 7 дней, что характерно для Y. pestis (рисунок 3).

Изученные штаммы, за исключением Y. pestis 26 показали высокую вирулентность. При этом штамм Y. pestis 3 вызывал более раннюю смерть мышей, как линии BALB/c, так и C57BL/6 (p=0,001 и p=0,003, соответственно). Разницы в чувствительности инбредных линий мышей не выявлено. Мыши, зараженные штаммом Y. pestis 26, были эвтаназирован на 7 день. При некропсии инфекционного процесса не выявлено. Посев из легких и селезенки на агар Хоттингера не показал рост Y. pestis.

3.4. Изучение генотипических свойств Yersinia pestis

Были изучены 35 образцов ДНК штаммов чумного микроба из Илийского межгорного, Прибалхашского и Северо-Приаральского автономных очагов чумы.

Для выявления ДНК чумного микроба были использованы ПЦР тест-система «Plague qPCR» ННЦООИ. Выделение ДНК проводили с использованием набора «РИБО-преп» Кат. № К2-9-Et-100, Россия. Программа амплификации представлена в таблице 2, выявляемые гены представлены в таблицах 3 и 4.

Среди изучаемых штаммов был выявлен один штам из Прибалхашского автономного очага с отсутствием значимого гена вирулентности pst, который расположен на плазмиде pPCP1. Остальные 34 образца ДНК имели все три целевых гена (таблица 5, рисунок 4).

Проведено изучение штаммов с праймерами ripA-m3-f/ ripA-m3-r для анализа области пигментации. Для анализа области пигментации Yersinia pestis были использованы праймеры ripA-m3-f/ ripA-m3-r, кодирующий 4-гидроксибутират кофермента A трансферазы. Проведен анализ образцов ДНК штаммов чумного микроба с помощью праймеров к гену области пигментации ripA и к гену 16S-M3 и (таблица 6) с одновременной детекцией видоспецифических мишеней в геноме Y. pestis. Пара праймеров к 16sRNA была использована для подтверждения принадлежности исследуемых штаммов к виду Y. pestis.

Анализ проводился путем стандартной ПЦР с учетом результатов реакции методом горизонтального гель-электрофореза. Программа амплификации указана в таблице 7.

В качестве референтного образца был использован вакцинный штамм EV, который считается дефектным по Pgm признаку Pgm–. Тестирование штаммов выявило наличие гена ripA у всех изучаемых штаммов чумного микроба. Результаты представлены на рисунке 5 и в таблице 8.

Генотипирование исследуемых изолятов проводилось на основе структуры VNTR локусов методом мультилокусного VNTR анализа (Multiple Loci VNTR Analysis, MLVA). Штаммы изучены методом MLVA по 18 VNTR локусам. При этом вначале проводился анализ по 7 наиболее вариабельным VNTR локусам (MLVA-7), а затем — по 11 локусам (MLVA-18). В качестве референтных образцов были использованы штаммы Y.pseudotuberculosis 2841 и ДНК четырех хорошо изученных штаммов Y. pestis, представляющих основные биовары чумного микроба: Pestoides F (биовар Microtus/Antiqua), Nepal516 (биовар Antiqua), KIM10+ (биовар Mediaevalis) и CO92 (биовар Orientalis). При филогенетическом анализе, кроме указанных штаммов, для сравнения были использованы данные по некоторым другим штаммам, взятые из GenBank NCBI (National Center for Biotechnology Information). В частности, были использованы данные о структуре исследуемых VNTR локусов двух штаммов Y. pseudotuberculosis: IP32953 (CP009712.1) и ATCC 6904 (CP008943.1), а также двух эволюционно древних штаммов Y. pestis: 3770 (CP006751.1) и Angola (CP009935.1).

Программа амплификации, используемая при MLVA-типировании штаммов чумного микроба, представлена в таблице 9.

Данная работа была рассчитана на изучение филогенетических особенностей исследуемых штаммов по 24 наиболее вариабельным VNTR локусам. Было проведено изучение по 18 локусам из 24. Исследованные локусы и праймеры для их генотипирования приведены на рисунке 6. Информация о структуре VNTR локусов, последовательностях праймеров, условиях проведения ПЦР и электрофоретического анализа продуктов амплификации получена из базы международного генбанка.

Амплификация проводилась на стандартных термоциклерах для классической ПЦР. Электрофоретическое разделение продуктов амплификации проводилось в 2% агарозном геле. Размер продуктов амплификации ДНК исследуемых штаммов чумного микроба определялся исходя из размеров фрагментов маркера молекулярного веса, а также из размеров продуктов амплификации ДНК референтных штаммов.

3.5. Филогенетический анализ

Анализ филогенетических связей исследуемых штаммов проводился с помощью программы PAUP 4.0. Составлялась бинарная матрица, где 1 — означало наличие признака, а 0 — отсутствие. Для иерархической кластеризации был использован алгоритм UPGMA (Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean). Оптимизация полученного филогенетического древа проводилась на графическом редакторе FigTree v.1.4.4.

На основе данных, полученных методом гель-электрофореза для каждого из 18 VNTR локусов исследуемых штаммов составлена таблица размеров продуктов амплификации (рисунок 7) и матрица для филогенетического анализа с помощью программы PAUP 4.0 (рисунок 8).

Филогенетическое дерево, созданное программой PAUP 4.0 и обработанное на графическом редакторе FigTree v.1.4.2, приведено на рисунке 9.

Для построения филогенетического дерева были взяты предварительные результаты молекулярного типирования методом MLVA. Изучены нуклеотидные последовательности 35-ти штаммов Y. pestis по 18 VNTR локусам из 24 вариабельных локусов. В построении дерева были также использованы нуклеотидные последовательности штаммов из других регионов мира, депонированные в NCBI GenBank. Полученное филогенетическое дерево показало разделение изученных штаммов на пять основных кластера. В кластер «A» вошли штаммы Y. pseudotuberculosis, включая казахстанский штамм 2841. Кластер «B» представлен древними штаммами чумного микроба: Y. pestis Angola и Y. pestis 3770. В этот же кластер вошел референтный штамм Y. pestis Pestoides F. В кластер «С» вошли два контрольных штамма: референтный штамм Y. pestis CO92 и вакцинный штамм Y. pestis EV-76, относящиеся к биовару Orientalis. Кластер «D» отображен одним представителем Antiqua: референтным штаммом Nepal516. Обширный кластер — «E» представлен изолятами, выделенными на территории Центральноазиатского пустынного очага чумы (Северо-Приаральский, Илийский межгорный и Прибалхашский автономные очаги). Присутствие в этом кластере референтного штамма KIM10, являющегося типичным представителем биовара Mediaevalis подтверждает, что все штаммы из кластера «E» относятся к биовару Mediaevalis, 2. MED1. Штаммы ветви 2. MED1 разделены на две отдельные филогенетические группы. Первая группа представлена политомией, состоящей как из одиночных штаммов, так и из кластеров штаммов, объединенных по месту их выделения. Вторая филогенетическая группа объединяет три кластера штаммов, выделенных в Илийском межгорном автономном очаге чумы. Составленная филогения указывает на то, что в Центрально-Азиатском очаге чумы существует стабильная популяция Y. pestis биовара Mediaevalis, 2. MED1.

4. Обсуждение

В настоящем исследовании проведено комплексное изучение 35 штаммов Yersinia pestis, выделенных в 2024 году из пустынных природных очагов Республики Казахстан. Полученные результаты дополняют современные данные о циркуляции возбудителя чумы в Центральной Азии [24], [25], [40]. Выявленная фенотипическая и генотипическая изменчивость соответствует ранее опубликованным данным, подтверждающим сложную структуру чумных очагов Казахстана [12], [19], [23].

Большинство изученных штаммов демонстрировали типичные признаки биовара Mediaevalis: ферментировали глицерин, глюкозу, мальтозу и арабинозу, проявляли кальций-зависимый рост при 37°C, а также были устойчивы к действию бактериофагов, характерных для данного биовара [41]. Вместе с тем обнаружены отдельные штаммы, у которых отмечено сниженное содержание антигена FI (фракция 1). Такие отклонения могут быть связаны с экологическими особенностями природных очагов и микроэволюционными процессами, протекающими в популяции возбудителя [42], [43].

Генетическое типирование методом мультилокусного анализа вариабельных тандемных повторов (MLVA) подтвердило преобладание генотипов ветви 2.MED1 биовара Mediaevalis, ранее неоднократно выявленных в природных очагах Казахстана и сопредельных странах [44]. Филогенетическое дерево, построенное по 18 VNTR-локусам, продемонстрировало чёткое разделение изученных штаммов на несколько кластеров, соответствующих отдельным природным очагам. Это подтверждает предположения о наличии устойчивых локальных популяций и возможных путях миграции грызунов-резервуаров на территории Центральной Азии [45].

Особое внимание заслуживает обнаружение одного штамма без плазмидного гена pst (pPCP1), кодирующего пестицин, фибринолизин и коагулазу. Потеря данного гена может быть связана с ослаблением вирулентности штамма, что было подтверждено экспериментальными данными. Подобные генетические потери ранее были описаны в литературе и связаны с процессами адаптации и эволюции чумного микроба в природных очагах [46].

Испытания на лабораторных животных (мыши линий BALB/c и C57BL/6) подтвердили высокую вирулентность большинства исследованных штаммов. Гибель животных при низких заражающих дозах (10² и 10³ КОЕ) в сроки 3–7 дней свидетельствует о значительной эпидемической опасности циркулирующих штаммов [40], [47]. Отсутствие значимых различий между линиями лабораторных животных также указывает на высокую стабильность фенотипа вирулентности исследованных штаммов Y. pestis.

Полученные данные подтверждают необходимость постоянного мониторинга природных очагов чумы с применением современных молекулярно-генетических методов (MLVA, SNP-типирование, WGS), что позволяет эффективно отслеживать эпидемиологическую ситуацию и своевременно выявлять возможные изменения в структуре популяции возбудителя [48], [49].

Таким образом, комплексный подход к изучению циркулирующих штаммов Y. pestis предоставляет важную информацию для оценки эпидемиологической опасности и разработки эффективных профилактических мероприятий в природных очагах Республики Казахстан.

5. Заключение

В настоящем исследовании реализован интегральный подход к изучению штаммов Yersinia pestis, выделенных в 2024 году из пустынных природных очагов Республики Казахстан. Проведённое комплексное исследование фенотипических, генотипических и вирулентных характеристик позволило получить глубокие знания о текущем состоянии и особенностях популяционной структуры возбудителя чумы в Центрально-Азиатском регионе. Результаты скрининга к АБП показали отсутствие у 35 изолятов Y. pestis к 72 антибактериальным препаратам по следующим основным группам: бета-лактамазы расширенного спектра — БЛРС (пенициллины, цефалоспорины, карбапенемы), монобактамы, макролиды, тетрациклины, аминогликозиды, амфениколы, гликопептидные, линкозамиды, фторхинолоны и антибиотики разных групп. Результаты генотипирования подтвердили, что большинство циркулирующих штаммов относятся к биовару Mediaevalis (ветвь 2.MED1) и демонстрируют типичные фенотипические и молекулярно-генетические характеристики. Генотипическое типирование методом MLVA подтвердило высокую стабильность популяционной структуры Y. pestis.

Таким образом, проведённое комплексное исследование расширяет существующие представления о популяционной структуре Y.ersinia pestis и подчёркивает необходимость продолжения регулярного эпизоотологического и молекулярно-генетического мониторинга природных очагов Казахстана. Дальнейшие исследования, включая применение новых технологий (WGS, CRISPR-типирование), могут дать ещё более детальное понимание механизмов эволюции и распространения возбудителя, а также способствовать разработке улучшенных стратегий управления рисками возникновения эпидемических вспышек чумы в Центральной Азии.

The additional file for this article can be found as follows: