1. Введение

Поиск новых противоопухолевых препаратов не теряет свою актуальность для медицины. Большой потенциал имеют комплексные соединения различных переходных металлов с органическими лигандами: аминокислотами, карбоновыми кислотами, азотистыми основаниями и т.д. Авторами [1] систематизирована информация об исследованиях противоопухолевых металлосодержащих препаратов, в том числе комплексных соединений меди (II). Ион Cu2+ является активным комплексообразователем.

Взаимодействие меди с ДНК обсуждается в работах [2], [3], [4], [5]. Обнаружено, что Сu2+ обладает наибольшей степенью сродства к азотистым основаниям ДНК и показано, что дозы CuSO4 больше 10 мг/кг вызывают окислительный стресс, апоптоз, повреждение ДНК и воспалительные реакции, которые способствуют дисфункции селезенки у мышей [6].  В работе [7] показано, что комплексные соединения меди проявляют хорошую активность как ингибиторы топоизомеразы. В качестве возможных лигандов исследовался и фенантролин.

1,10-Фенантролин (phen) — классический бидентатныйхелатирующийлиганд ионов переходных металлов, который легко входит в водных растворах в состав октаэдрических комплексов [Me(phen)(H2O)4]2+, [Me(phen)2(H2O)2]2+ и [Me(phen)3]2+ с катионами переходных металлов [8]. Стабильность комплексов [Me(phen)]2+ соответствует последовательности Ирвинга–Вильямса, константы их образования варьируются от 4,13 ([Mn(phen)]2+) до 9,25 ([Cu(phen)]2+) логарифмических единиц [9]. Комплексы фенантролина с ионами переходных металлов, включая Fe2+, Cu2+, Co2+, Zn2+, Mn2+, Ln3+, Ru2+, Rh3+ и Os2+, известны своей способностью взаимодействовать с ДНК, вызывая расщепление полинуклеотидных цепей [10], [11], [12].

Структура возможных комплексных соединений меди с фенантролином, а также их возможность применения в противоопухолевой терапии изучена авторами [13].

Необходимость получения новых противоопухолевых препаратов продиктована в том числе тем, что широко применяемые препараты комплексных соединений платины обладают высокой токсичностью [14]. Подбор оптимального соотношения липофильности/гидрофильности и токсичности играет большую роль при создании и изучении новых лекарственных препаратов [15], [16]. Липофильность — это свойство молекулы, определяющее ее способность проникать через биологические мембраны и непосредственно влияющая на такие важные биофармацевтические парматерты как растворимость, абсорбция в кровоток, биотрансформация, экскрекция [17], [18]. Согласно критериям Липински, липофильность соединения (LogP) не должна быть больше 5. Считается, что при таких значениях обеспечивается наилучшее соотношение терапевтического эффекта и токсичности.

В настоящее время при доклиническом исследовании токсичности молекул invitro используется метод фенотипического скрининга — оценка цитотоксического действия лекарственных препаратов в отношении различных линий опухолевых клеток с последующим определением концентрации, подавляющей рост 50% клеток, вызывающей гибель 50% клеток и вызывающей снижение функции у 50% клеток [19]. Данный метод не требует понимания механизма химического воздействия соединения на клетки [20].

В направлении совершенствования методов доклинических исследований представляет интерес метод динамической спекл-интерферометрии. Спекл-структуры — это пятнистые картины, возникающие при когерентном освещении неоднородных сред или объектов. Так как распределение неоднородностей структуры носит случайный характер, то полученное пятнистое изображение является носителем измерительной информации. Спекл-интерферометрия используется для высокоточного интерференционного контроля объектов с оптически грубыми поверхностями, наблюдения астрономических объектов через турбулентную атмосферу Земли [21]. Метод динамической спекл-интерферометрии основан на том, что внутриклеточные процессы в живых клетках, культивированных или осажденных на прозрачной подложке, случайным образом изменяют фазы прошедших через клетку волн и, таким образом, по характеру изменения картины спеклов можно получить сведения о процессах, протекающих на поверхности или в глубине клетки [22, С. 41]. Авторами [23], [24], [26] опубликованы работы, в которых изучается применение метода динамической спекл-интерферометрии при оценке изменений метаболической активности клеток при воздействии температуры, вируса герпеса, а также подробно рассмотрена теория метода, описана экспериментальная установка, методика расчетов. Таким образом, метод является перспективным в направлении анализа внутриклеточных процессов, но также имеет ряд недостатков. Во-первых, культивированные клетки находятся в питательной среде, содержащей множество аминокислот и других потенциальных лигандов, которые могу образовать соединение с исследуемым металлом. Во-вторых, для оценки критериев токсичности молекул новым методом необходимо оценить их другими известными методами.

Липофильность и потенциальную токсичность часто сопоставляют. Для оценки этих свойств целесообразно использовать методы количественной корреляции структура — активность (ККСА), включающие в себя применение различных компьютерных программ, алгоритмы которых основаны на сравнении вкладов структурных фрагментов молекулы с соединениями из базы данных. Примерами таких программ являются Molinspiration, Petra, Osyris и др.

Сложность и многообразие структур потенциальных лекарственных препаратов требует применения новых методов предсказания и оценки свойств молекул, обеспечивающих адекватную интерпретацию данных доклинических исследований, которые потом могут быть успешно перенесены в клиническую практику.

В рамках данной работы рассмотрена возможность применения метода для оценки токсичности молекул потенциальных лекарственных препаратов.

Цель — определение токсичности комплексного соединения меди с фенантролином, полученного при концентрации реагентов на уровне ПДК в воде; оценка влияние различных аминокислот на данное свойство.

2. Материалы и методы

Синтез комплексного соединение меди с фенантролином.

Для приготовления комплексного соединения растворы CuSO4·5H2O с концентрациями 0,95 мг/л и фенантролина 0,3 мг/л смешивались в соотношении 1:2.

Раствор сульфата меди получали разбавлением исходного 0,01 М раствора: 1,5 мл в 100 мл раствора, так, чтобы концентрация по меди составила 9,5 мг/л. Это необходимо, так как в дальнейшем раствор вводится в количестве 10% от состава питательной среды, таким образом, происходит разбавление еще в 10 раз и концентрация Сu(II) составляет 0,95 мг/л (ориентиром здесь служит ПДК меди в питьевой воде — 1 мг/л [27]).

Раствор фенантролина готовили из исходного раствора с концентрацией 1 мг/л. Перед добавлением в питательный раствор исходный раствор фенантролина разбавляли 3 мл в 100 мл раствора так, чтобы концентрация составила 3 мг/л и при дальнейшем вводе в питательный раствор в количестве 10% от состава питательной среды произошло разбавление в 1 раз и концентрация его бы составила 0,3 мг/л, что также не превышает ПДК фенантролина в питьевой воде — 0,3 мг/л [28].

Образование комплексного соединения обнаруживали по появлению пика на спектре при длине волны 270 нм на спектрофотометре «Leki» (Финляндия) в кювете 50 мм (рис.1).

Для контроля идентичности состава растворов, приготовленных для серии параллельных измерений у растворов определяли электрическую проводимость (кондуктометр «АНИОН 7020»), водородный показатель (анализатор жидкости «Эксперт-001») и оптическая плотность  при длине волны 220 и 270 нм в кварцевой кювете на 50 мм (спектрофотометр «Leki» (Финляндия)). 

Предварительная оценка токсичности комплексного соединения методом динамической спекл-интерферометрии.

Метод динамической спекл-интерферометрии был реализован согласно публикациям авторов [23], [24], [25]. В рамках данного исследования клетки линии L-41 (раковые клетки) подвергались воздействию приготовленных растворов сульфата меди, фенантролина и комплексного соединения меди с фенантролином. Регистрировались основные параметры, предложенные авторами [23], [24], [25] в качестве критерия оценки метаболической активности клеток – среднеквадратичное отклонение и время релаксации флуктуаций показателя преломления m–го процесса на участке (метод позволяет усреднять результаты, полученные на участке размером 10 клеток). Параметры регистрировались для клеток в норме и после введения реагента. Предварительно оценен спад клеточной активности в процентах после введения реагента относительно нормы.

3. Результаты и их обсуждение

Для эксперимента готовили растворы сульфата меди, фенантролина и комплексного соединения меди с фенантролином. С помощью таких показателей как электропроводность, водородный показатель и оптическая плотность контролировали состав растворов, приготовленных для серии параллельных измерений. В таблице 1 приведены значения физико-химических характеристик приготовленных растворов с рассчитанной величиной отклонения. Полученная величина отклонения характеристик раствора от контрольных показателей позволяет обеспечить воспроизводимость результатов эксперимента с культурой клеток.

Образование комплексного соединения между ионом меди и фенантролином подтверждали, сравнивая спектры приготовленных растворов (рисунок 1). У раствора сульфата меди не наблюдается максимума поглощения в выбранном диапазоне длин волн, у раствора фенантролина два максимума поглощения — при длине волны 225 нм и 250 нм, у раствора, в который добавлены аликвота меди и аликвотафенантролина в мольном соотношении 1:2 имеется один максимум поглощения при длине волны 270 нм. Появление сдвига максимума поглощения свидетельствует об образовании комплексного соединения между медью и фенантролином. Именно длины волн, при которых в растворах наблюдаются максимумы поглощения и были выбраны для определения контрольного показателя оптической плотности приготовленных растворов для обеспечения воспроизводимости результатов.

Метод динамической спекл-интерферометрии показал, что ион меди вызывает больший спад клеточной активности в процентах, по сравнению с раствором фенантролина и раствором комплексного соединения меди с фенантролином. Это может быть связано с большей токсичностью свободного иона меди, а также с тем, что в условиях эксперимента происходит включение постороннего лиганда - аминокислоты, входящей в состав питательной среды в структуру комплексного соединения. Новое комплексное соединение за счет другой структуры обладает отличной биологической активностью, к примеру, значение липофильности может отличаться.

Для структуры комплексного соединения меди с фенантролином, приведенной в [13] было определено значение липофильности с помощью ПО Molinspiration (https://www.molinspiration.com/). Включение посторонних лигандов в состав комплексного соединения меди с фенантролином изучалось в работах [29],  [30]. Взяв за основу эту структуру предположили строение новых образующихся систем «медь - фенантролин — заменимая аминокислота, входящая в состав питательной среды» (рис.2) и рассчитали значения липофильности с помощью ПО Molinspiration.В состав питательной среды, используемой в рамках данной работы «Среда 199 с солями Хенкса, с глутамином» входят заменимые аминокислоты: глицин, аланин, серин, аспарагиновая кислота, аспарагин, глутаминовая кислота, глутамин. В таблице 3 приведены полученные значения LogP (липофильности) для соединений с предполагаемым составом.

Для всех комплексных соединений с включенным лигандом-заменимой аминокислотой значение липофильности меньше, чем у соединений меди с фенантролином. Однако у всех соединений величина LogP выше 5, что, согласно критерию Липински говорит о высокой токсичности данных молекул.

Также близкие величины снижения клеточной активности под воздействием всех трех растворов может быть связано с тем, что концентрации иона меди и фенантролина выбраны в соответствии с нормативными документами, определяющими их допустимый уровень содержания (ПДК) в питьевой воде. Однако, для того чтобы увеличить чувствительность метода динамической спекл-интерферометрии до уровня, позволяющего различать какие процессы и с какой скоростью подавляются под воздействием токсичных веществ, необходимо использовать концентрации ниже установленных ПДК.

Метод динамической спекл-интерферометрии позволяет количественно определять параметры, характеризующие активность метаболизма клеток, однако к настоящему моменту получаемые данные нуждаются в тщательной интерпретации, так как пока что очень сложно сказать, какие именно процессы подавляются при воздействии тех или иных и в каком процентном соотношении. Накопив базу данных экспериментальных кривых процессов, протекающих в клетках под воздействием различных реагентов или других внешних условий, можно будет количественно оценивать снижение интенсивности конкретных процессов (синтез протеинов, дыхание, размножение и пр.) В рамках данного исследования используются предварительно полученные данные о средней величине спада клеточной активности — рассчитанной на основании 7 повторений значение для раствора меди  —  47%, 4 повторений для раствора фенантролина — 36%, и 6 повторений для раствора комплексного соединения меди с фенантролином — 38%. Стоит отметить, что все значения близки между собой и для комплексного соединения меди с фенантролином не наблюдается усиление эффекта или величины снижения клеточной активности равной сумме для растворов сульфата меди или фенантролина. Полученные данные согласуются с результатами, полученными другими авторами [29]. В этой статье показано, что взаимодействие с компонентами клетки и гибель клеток связаны с раздельным действием ионов Cu2+ и молекулы фенантролина, а не частицы комплексного соединения. Также авторы этой работы предлагают изучить применимость этого утверждения на комплексные соединения меди с другими лигандами.

Кроме того, близкие величины снижения клеточной активности под воздействием всех трех растворов могут быть связаны с тем, что концентрации иона меди и фенантролина выбраны в соответствии с нормативными документами, определяющими их допустимый уровень содержания (ПДК) в питьевой воде.

Таким образом, можно заключить, что метод динамической спекл-интерферометрии позволяет количественно определять параметры, характеризующие активность метаболизма клеток, однако для обоснования критериев токсичности необходимо получить зависимости по снижению клеточной активности от концентрации, которая позволит обосновать терапевтическую дозу с минимальным токсичным эффектом.

4. Заключение

1. Метод динамической спекл-интерферометрии экспериментально подтвердил теоретический расчет: комплексное соединение меди (II) c 1,10-фенантролином имеет токсический эффект и снижает клеточную активность на 38%.

2. При введении аминокислоты липофильность смешанного комплексного соединения уменьшается и незначительно уменьшается токсичность (согласно критерию Липински). Следовательно, присутствие аминокислот в питательном растворе не должно существенно повлиять на оценку свойств комплекса меди (II) с 1,10-фенантролином.

3. Метод динамической спекл-интерферометрии позволяет количественно определять параметры, характеризующие активность метаболизма клеток, однако для обоснования критериев токсичности необходимо получить зависимость снижения клеточной активности от концентрации комплексного соединения меди(II) с 1.10-фенантролином, концентрацию комплекса можно определять спектрофотометрически при длине волны 270 нм.

The additional file for this article can be found as follows: