1. Введение

Гидроксикоричные кислоты представляют большой интерес из-за широкого спектра фармакологической активности, они практически нетоксичны

[1][2]Стевия, природный подсластитель, завоевала популярность как здоровая альтернатива сахару и искусственным заменителям. Ее получают из листьев растения Stevia rebaudiana. Стевия обладает нулевой калорийностью и гликемическим индексом, что делает ее привлекательной для людей, следящих за весом и уровнем сахара в крови, Стевия обладает антиоксидантной активностью. В России интродукция и комплексное исследование этой лекарственной культуры начались в 1990-х годах. Пищевая промышленность активно использует стевию в производстве диетических продуктов и напитков. Она входит в состав газированных напитков, соков, конфет и жевательной резинки, предназначенных для людей, страдающих диабетом или желающих снизить потребление сахара  [3], [4].

Одним из самых распространенных методов количественного определения гидроксикоричных кислот, является прямая спектрофотометрия. Данный метод используется как зарубежными, так и отечественными учеными

[5][6][7][8][9]

Проблема стандартизации растительного сырья на основе стевии является актуальной задачей, поскольку данный препарат содержит важные биологически активные соединения, такие как сладкие дитерпеновые гликозиды, сапонины, гидроксикоричные кислоты. Антиоксидантные свойства стевии обусловлены присутствием в ней различных фенольных соединений, включая флавоноиды и другие полифенолы. Механизмы антиоксидантного действия включают в себя донирование электронов свободным радикалам, что стабилизирует их и предотвращает дальнейшее повреждение клеток. Доминирующим компонентом гидроксикоричных кислот в листьях стевии является хлорогеновая кислота. С химической точки зрения, хлорогеновая кислота — это сложный эфир кофейной и хинной кислот. Эта комбинация придает ей уникальные свойства, обуславливающие ее роль как мощного антиоксиданта. В мире, переполненном свободными радикалами, неустойчивыми молекулами, повреждающими клетки и способствующими старению и развитию болезней, антиоксиданты, такие как хлорогеновая кислота, играют жизненно важную роль. Они нейтрализуют эти вредные соединения, защищая наши клетки от разрушения. Однако потенциал хлорогеновой кислоты не ограничивается антиоксидантной активностью. Исследования показывают, что она может обладать противовоспалительными, антидиабетическими и даже противораковыми свойствами. Предполагается, что она способна улучшать чувствительность к инсулину, снижать уровень сахара в крови и замедлять рост некоторых видов раковых клеток. Отсутствие нормативной документации и включения стевии в государственную фармакопею затрудняет ее использование в медицинской, фармацевтической и пищевой промышленности, а также повышает риск несоответствия качества сырья и продукции. Разработка стандартов, методик контроля и нормативных документов является важным шагом для обеспечения безопасности, эффективности и воспроизводимости использования стевии как натурального заменителя сахара и биологически активного компонента

[10][11]

Потенциальная польза антиоксидантной активности стевии может быть широкой. Включение стевии в рацион может быть одним из способов увеличения потребления антиоксидантов, особенно для людей, стремящихся снизить потребление сахара и искусственных подсластителей.

2. Методы и принципы исследования

Для подтверждения присутствия гидроксикоричных кислот в листьях стевии использовали тонкослойную хроматографию (ТСХ)

[6][9]

Методика извлечения гидроксикоричных кислот включает следующие этапы: подготовка сырья (взять 1,0 г измельченного растительного сырья с точной массой), экстракция (поместить сырье в колбу со шлифом вместимостью 250 мл, добавить 100 мл этилового спирта 70%), нагревать на кипящей водяной бане в течение 45 минут для извлечения гидроксикоричных кислот. Проводится фильтрация: после охлаждения полученный экстракт фильтровать через бумажный фильтр, смоченный тем же спиртом, чтобы избежать потерь; отбрасывать первые 10 мл фильтрата (раствор А), поскольку они могут содержать нежелательные компоненты или примеси. Приготовление анализируемого раствора: в мерную колбу вместимостью 25 мл взять 0,5 мл полученного фильтрата (раствор А), довести объем раствора до 25 мл этиловым спиртом до метки (образуется раствор Б). Для измерения и анализа содержания гидроксикоричных кислот используется спектрофотометр СФ-102, измерения проводят при длине волны 330 нм в этанольном растворе (растворе Б), который служит образцом сравнения, так как этиловый спирт — экстрагент. Содержание суммы гидроксикоричных кислот рассчитывали по формуле:

[LATEX_FORMULA]X=(D ×100×25×100)/(497×m×0,5×100-W)[/LATEX_FORMULA],

где D — оптическая плотность испытуемого раствора;

m — масса сырья, г;

W — потеря в массе при высушивании сырья (влажность), %;

497 — удельный показатель поглощения хлорогеновой кислоты при 330 нм.

3. Основные результаты и обсуждение

На полученной хроматограмме (рис. 1) видно, что в извлечении из листьев стевии обнаруживаются две характерные зоны адсорбции: оранжевого цвета с Rf около 0,55, которая соответствует уровню СО хлорогеновой кислоты, и желтого цвета с Rf около 0,64, соответствующая уровню СО цинарозида. Таким образом, для качественного анализа листьев стевии и её препаратов методом тонкослойной хроматографии рациональным является использование в качестве веществ-стандартов именно хлорогеновой кислоты. Это позволит точно идентифицировать присутствие хлорогеновой кислоты по соответствующему Rf и сравнить с контрольным образцом, а также провести количественный анализ путем расчетов по полученным значениям Rf.

[6][12][13]

Результаты исследований по выбору оптимального соотношения «сырье-экстрагент» приведены в таблице 2. Оптимальными параметрами экстракции являются: извлечение 70% этиловым спиртом на кипящей водяной бане в течение 45 минут в соотношении «сырье-экстрагент» — 1:100.

Зависимость выхода биологически активных соединений из стевии от степени измельченности сырья представлена в таблице 3. Следует отметить, что, по нашим данным, степень измельчения от 0,5 до 2 мм сильного влияния на экстракцию не оказывает. Однако в качестве оптимальной нами выбрана степень измельчения 1 мм.

Размер частиц 1 мм обеспечивает оптимальную поверхность контакта сырья с экстрагентом, 70% этиловый спирт является оптимальным растворителем для извлечения гидроксикоричных кислот, соотношение 1:100 гарантирует достаточное количество экстрагента для максимального извлечения, 45-минутная экстракция обеспечивает полное извлечение компонентов при температуре 90°C, данная температура ускоряет процесс экстракции без разрушения термолабильных компонентов. Необходимо тщательно измельчать сырье до однородного состояния и соблюдать точное соотношение сырья и экстрагента, контролировать температуру водяной бани, обеспечивать равномерное перемешивание. Данная методика позволяет получить максимально полное извлечение гидроксикоричных кислот из листьев стевии при сохранении их качественных характеристик. Она может быть рекомендована для анализа и контроля качества растительного сырья.

Выбор сделан в пользу одностадийного процесса экстракции, так как происходит минимизация ошибок при пробоподготовке, сокращение времени анализа, простота выполнения процедуры, уменьшение потерь аналитика, повышение воспроизводимости результатов. 

Результаты определения количественного содержания суммы гидроксикоричных кислот в стевии листьях представлены в таблице 4.

Выявлено, что содержание гидроксикоричных кислот, при использовании в качестве экстрагента этанола 70% составляет 10,71%.

Разработка методики количественного определения предусматривает проведение валидации. Проведена метрологическая оценка предложенной методики. В результате пяти параллельных определений (Хср = 10,54) установлена дисперсия (S2 = 0,007), стандартное отклонение (S = 0,085), стандартное отклонение среднего результата (Sхср = 0,038), относительное стандартное отклонение среднего результата (RSD = 0,81%), полуширина доверительного интервала (ΔХср = 0,11). Погрешность среднего результата (ε) суммарного содержания гидроксикоричных кислот в сырье стевии с доверительной вероятностью (Р) 95% составила ±1,01% в пересчете на хлорогеновую кислоту.

В соответствии с требованием нормативной документации необходимо проведение валидации методики количественного определения. Валидацию проводили по методике описанной в ОФС.1.1.0012 «Валидация аналитических методик» Государственной Фармакопеи РФ XV [14]. Верификацию разработанной методики проводили по показателям: специфичность, линейность, прецизионность, правильность.

Линейность методики определяли для серии растворов хлорогеновой кислоты с концентрацией от 0,002 до 0,012 мг/мл. По полученным данным зависимости оптической плотности от концентрации хлорогеновой кислоты построили график и рассчитали параметры уравнения линейной регрессии (рис. 3). Коэффициент корреляции составил 0,9939.

Прецизионность методики (уровень повторяемости) оценивали путем анализа исследуемого образца в 5-кратной повторности при одинаковых условиях. Согласно полученным результатам, среднее значение составило 10,71%, дисперсия (S2) – 0,009, стандартное отклонение (S) — 0,096, относительное стандартное отклонение среднего результата (RSD) — 0,90%, полуширина доверительного интервала (Δхср– 0,12. Погрешность среднего результата (ɛ) суммарного содержания гидроксикоричных кислот с доверительной вероятностью (Р) 95% в сырье стевии составила ±1,12%.

Для оценки внутрилабораторной прецизионности количественный анализ спиртового экстракта проводился другим аналитиком в пятикратной повторности (табл. 5).

Метрологические характеристики. Аналитик 1 (ХсрMissing Mark : sub% = 10,72, S2Missing Mark : sup = 0,011, S = 0,11, SХср.Missing Mark : sub= 0,049, RSD, % = 1,03, ΔХсрMissing Mark : sub% = 0,14, ɛ% = 1,24). Аналитик 2 (ХсрMissing Mark : sub% =10,73, S2Missing Mark : sup = 0,010, S = 0,10, SХср Missing Mark : sub= 0,044, RSD % = 0,93, ΔХсрMissing Mark : sub% = 0,12, ɛ% = 1,18).

Установлено, что дисперсия результатов анализа обоих химиков статистически эквивалентна и различия между полученными значениями незначительны. Ошибка среднего результата с доверительной вероятностью 95% составляет не более 1,24% (табл. 5). Расчетное значение t-критерия Стьюдента составляет 0,01 < 2,306 (95%).

Правильность методики исследования извлечения из листьев стевии (табл. 6) устанавливали путем определения содержания гидроксикоричных кислот в пересчете на хлорогеновую кислоту в пробах, полученных путем добавления 0,15, 0,20, 0,25, 0,30, 0,35 мл раствора СО образца хлорогеновой кислоты. Оценку правильности выполняли относительно среднего процента восстановления — процентной доли полученного значения суммарного содержания гидроксикоричных кислот в пробе от ожидаемого, средняя величина которого должна находиться в пределах 100 ± 3% [14].

Метрологические характеристики: Хср% = 99,93, Хср ± ΔХср = 99,93 ± 0,37%, ɛ = 0,37%, P = 95%, n = 5, f = 4.

Показано, что открываемость составляет от 99,59 до 100,27%. Разработанная методика количественного определения суммарного содержания гидроксикоричных кислот отвечает критерию правильности, рассчитано среднее значение открываемости, которое составляет 99,93%.

Специфичность методики оценивали по соответствию максимумов поглощения комплексов гидроксикоричных кислот из листьев стевии и раствора стандартного образца хлорогеновой кислоты (рис. 2).

В результате проведенной валидации показано, что методика количественного определения суммарного содержания гидроксикоричных кислот в листьях стевии имеет приемлемую степень специфичности, линейности, прецизионности и правильности. Результаты показали, что ошибка анализа находится в пределах ошибки единичного определения и составляет менее 2%.

4. Заключение

Методом тонкослойной хроматографии получили подтверждение наличия хлорогеновой кислоты. Представлена методика количественного определения суммарного содержания гидроксикоричных кислот, при длине волны λ = 330 нм. Определены  оптимальные условия экстракции: степень измельчения  (1 мм), экстрагент  (70% этанол), соотношение сырьё/экстрагент  (1:100), время экстракции (45 минут), температура (кипящая водяная баня). Определено содержание гидроксикоричных кислот в листьях стевии в пересчёте на хлорогеновую кислоту

—

The additional file for this article can be found as follows: