1. Введение

Стероидные гормоны являются одним из классов соединений, которые действуют как загрязнители и эндокринные разрушители [1], [2], [3], [4]. Среди стероидных гормонов эстрогены, прогестины и андрогены являются половыми гормонами, и отвечают за наиболее интенсивные изменения в эндокринной системе [5]. Применение этих препаратов у людей происходит в основном при гормонозаместительной терапии, для контроля рождаемости и лечения рака [6], [7]. У животных андрогенные гормоны часто используются для быстрого роста [8]. Использование стандартных методов очистки воды может быть недостаточным по отношению к эндокринным разрушителям, так как эти соединения встречаются в питьевой воде [9], [10], [11], [12], [13]. Присутствие гормонов в окружающей среде даже в низких концентрациях может оказывать неблагоприятное воздействие на репродуктивные, неврологические, иммунологические и метаболические функции как у людей, так и у животных [14].

Концентрация загрязняющих веществ в воде и сточных водах может сильно различаться в зависимости от скорости сброса, выпадения осадков, температуры и используемых технологий очистки [15]. Для измерения эстрогенных гормонов на следовых уровнях необходимо извлечь их из воды и сконцентрировать при помощи различных методов экстракции. Твердофазная экстракция является наиболее часто используемым методом извлечения стероидных гормонов из воды и природных матриц, обеспечивающим более высокую эффективность извлечения [16]. Однако в литературе также сообщалось и о жидкостной экстракции [17]. Существует несколько основных методов концентрирования гормонов для дальнейшего анализа: жидкостно-жидкостная экстракция (LLE), сверхкритическая флюидная экстракция (SFE), твердофазная экстракция (SPE).

2. Основная часть

2.1. Жидкостно-жидкостная экстракция (LLE)

Жидкостно-жидкостная экстракция (LLE) (рисунок 1) основана на принципе, согласно которому растворенное или аналитное вещество может распределяться в определенном соотношении между двумя несмешивающимися растворителями, обычно водой (водная фаза) и органическим растворителем (органическая фаза). В начале 1970-х годов классическая LLE экстракция впервые была применена для очистки цитокининов [18]. Было обнаружено, что, когда кинетин в кислом водном растворе был разделен три раза с равными объемами этилового эфира, только около 50% кинетина перешло в эфирную фазу. Однако при разделении с этилацетатом более 90% кинетина перешло в этилацетатную фазу [19].

Все встречающиеся в природе гормоны могут быть выделены из экстрактов с 50% или более степенью извлечения с использованием LLE. Однако его недостатками являются низкая чувствительность, поскольку он не подходит для ультра-следовых определений, экстракция занимает много времени, а растворители небезопасны для окружающей среды. Поэтому были разработаны некоторые улучшенные методы LLE для упрощения процедур подготовки образцов, включая микроэкстракцию одиночной капли (SDME), экстракцию смачивающей пленки (WFE), экстракцию точки помутнения (CPE), гомогенную экстракцию жидкость-жидкость (HLLE), дисперсионную микроэкстракцию жидкость-жидкость (DLLME) и дисперсионную микроэкстракцию жидкость-жидкость на основе затвердевания плавающей органической капли (DLLME-SFO) [20].

В LLE смешиваются несмешивающийся органический растворитель и водная проба. Неполярные соединения распределяются в органическую фазу, оставляя полярные фрагменты в водной фазе. Добавляется несмешивающийся органический растворитель, образцы энергично перемешиваются для переноса аналитов из образца в органическую фазу и центрифугируются для разделения слоев. После центрифугирования органический слой переносится и выпаривается досуха. К выпаренному экстракту добавляется восстанавливающий раствор, контейнер герметизируется и перемешивается для растворения аналитов и получения инъекционной матрицы [21].

Преимущества LLE включают низкую стоимость материалов и высокую селективность, возможность концентрировать аналиты при выполнении обширной очистки матрицы. Недостатками являются сложность процесса, низкая производительность при ручном варианте исполнения, высокие затраты на обученный персонал высокой квалификации, длительность экстракции. Кроме того, поскольку полярные соединения плохо экстрагируются, метаболиты могут иметь низкую степень извлечения или требовать гидролиза глюкуронида/сульфата перед LLE. Иногда происходит неполное разделение слоев — образование эмульсии, и разрушение эмульсии замораживанием или добавлением соли может быть проблематичным. Чистый, воспроизводимый перенос органического слоя в другой контейнер для выпаривания является трудоемким и зависит от техники выполнения, поэтому является основным источником изменчивости результата [22].

2.2. Сверхкритическая флюидная экстракция (SFE)

Сверхкритическая флюидная экстракция (SFE) (рисунок 2) использует сверхкритическую жидкость, чаще всего CO2, в качестве растворителя для подвижной фазы при экстракции. Собственная низкая вязкость и высокая диффузионная способность сверхкритического CO2 делают SFE более быстрым и эффективным методом по сравнению с традиционной жидкостной экстракцией. Это обеспечивает более высокие скорости потока и, следовательно, более быстрое время экстракции без необходимости в системе высокого давления. После экстракционного сосуда находится регулятор обратного давления, который обеспечивает требуемое обратное давление для поддержания CO2 в сверхкритическом состоянии и является неотъемлемой частью производительности экстракции [23].

Одним из преимуществ SFE экстракции является селективность — полярность CO2 сильно варьируется в зависимости от давления, которому он подвергается. Это делает CO2 настраиваемым растворителем, который позволяет пользователю находить точные условия для избирательного извлечения интересующих соединений. Это свойство CO2 значительно снижает необходимость в очистке после экстракции, которая была бы необходима при большинстве методов экстракции растворителем [24]. Также к преимуществам метода SFE является отсутствие остаточных растворителей — учитывая газообразное состояние CO2 при атмосферных условиях, полученный экстракт не требует длительного времени нахождения в роторном испарителе, необходимого для сушки аналитов, извлеченных растворителем [25].

Метод SFE обеспечивает меньшую длительность процесса экстракции благодаря высокой диффузионной способности и низкой вязкости CO2 в его сверхкритическом состоянии. Экстракция обычно занимает в разы меньше времени по сравнению с экстракцией растворителем [26].

Высокий выход продукта также является преимуществом SFE — из-за повышенной температуры и давления сверхкритический CO2 может проникать во многие матрицы, в которые растворители не могут проникнуть, тем самым обеспечивая большую площадь контакта поверхности, что, в свою очередь, увеличивает выход продукта. Также данный метод обеспечивает низкие эксплуатационные расходы — стоимость извлечения значительно ниже, за счет низкой стоимости CO2, в сравнении с эквивалентным количеством растворителя [27], [28].

2.3. Твердофазная экстракция (SPE)

Твердофазная экстракция (SPE) (рисунок 3) — это метод экстракции твердого тела в жидкость, при котором соединения, растворенные или суспендированные в жидкой смеси, разделяются, изолируются или очищаются от других соединений в этой смеси в соответствии с их физическими и химическими свойствами. Аналитические лаборатории используют твердофазную экстракцию для концентрирования и очистки образцов для анализа.

В методе SPE используется сродство растворенных веществ, растворенных или суспендированных в жидкости (подвижная фаза), к твердой насадке внутри небольшой колонки, через которую проходит образец (неподвижная фаза), для разделения смеси на желаемые компоненты. Результатом является то, что либо интересующие аналиты, либо нежелательные примеси в образце удерживаются на неподвижной фазе. Часть, которая проходит через неподвижную фазу, собирается или отбрасывается в зависимости от того, содержит ли она интересующие аналиты или нежелательные примеси. Если часть, удерживаемая на неподвижной фазе, включает желаемые аналиты, их затем можно удалить из неподвижной фазы для сбора на дополнительном этапе, на котором неподвижная фаза промывается соответствующим элюентом [29]. Возможно неполное извлечение аналитов с помощью SPE, вызванное неполной экстракцией или элюированием. В случае неполной экстракции аналиты не имеют достаточного сродства к неподвижной фазе, и часть из них останется в пермеате. При неполной элюции часть аналитов остается в сорбенте, поскольку используемый элюент не имеет достаточно сильного сродства [30].

3. Обсуждение

Кроме данных основных методов существует также множество способов экстракции: Г. Андалури 2017 и соавторами был проведен статистический анализ данных для сравнения эффективности повышения концентрации гормонов различными методами экстракции из воды [31].

По методу LLE брали 150 мл метиленхлорида помещали в непрерывный экстрактор и 300 мл в колбу для перегонки. Водный образец заливали в экстрактор. Контейнер для образца промывали 100 мл метиленхлорида и добавляли в экстрактор. Экстракция начиналась с медленного нагревания метиленхлорида в колбе для перегонки. Температуру регулировали так, чтобы от одной до двух капель метиленхлорида в секунду падали с кончика конденсатора в воду. После 24 ч кипячения и экстракции органические слои объединяли, а остаточную воду удаляли путем добавления безводного сульфата натрия. Затем образец концентрировали, высушивали, дериватизировали и анализировали.

SFE проводили в соответствии с методом 1698 Агентства по охране окружающей среды США (EPA) [32]. 1 л водного образца был пропитан мечеными стандартами и залит в делительную воронку. Затем образец извлекали при помощи 100 мл метиленхлорида. Органическому слою давали отстояться в течение 10 мин и пропускали через стеклянную воронку, примерно наполовину заполненную безводным сульфатом натрия, с использованием стекловолоконной фильтровальной бумаги. Экстракцию повторяли еще два раза, а затем растворитель концентрировали, дериватизировали и анализировали на ГХ.

Методы SPE подробно описаны Г. Андалури и соавторами [31]. Картриджи SPE были предварительно обработаны 6 мл метанола и 6 мл реагентной воды. Отфильтрованные водные образцы затем пропускались через картридж SPE со скоростью потока 5–10 мл/мин. Картридж промывали 6 мл воды Milli-Q, высушивали под вакуумом в течение 10 мин и элюировали 6 мл метанола. Метанольный элюент высушивали, дериватизировали и анализировали с помощью ГХ/МС/МС.

Авторы исследования пришли к выводу, что все методы экстракции, описанные в стандартной методике 1698 Агентства по охране окружающей среды США являются надежным способом определения концентрации гормонов. Для анализа питьевой воды используется разработанный стандартный метод 539 [33], в котором описан способ подготовки и отбора проб, концентрирования гормонов и анализа. Выбор оптимальной методики должен осуществляться в соответствии с доступным оборудованием для анализа.

Анализ стероидных гормонов может быть выполнен с использованием газовой или жидкостной хроматографии (ГХ или ЖХ) в сочетании с масс-спектрометрией (МС). Обе эти технологии предлагают схожие пределы обнаружения и специфичности [34].

ГХ с масс-спектрометрическим детектированием (ГХ-МС) является одним из наиболее распространенных методов исследования концентрации гормонов в воде [35], [36], [37]. Однако некоторые соединения невозможно определить с помощью ГХ без дериватизации, поскольку они термически нестабильны, полярны или ионны. Этап дериватизации делает подготовку образца трудоемкой и длительной, увеличивает возможность загрязнения и ошибок и может привести к деградации лабильных соединений.

Жидкостная хроматография в сочетании с масс-спектрометрией (ЖХ-МС) может использоваться для прямого анализа эстрогенов без предварительной дериватизации образца, но используемое для этого оборудование имеет высокую стоимость [38]. Одним из недостатков данного метода является эффект подавления сигнала, который отрицательно влияет на воспроизводимость и точность анализов [39]. Кроме того, эти приборы не получили широкого распространения из-за своей цены.

Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) с УФ-детектированием и автосэмплером — это быстрый, простой, удобный в использовании и широкодоступный метод, обеспечивающий короткое время анализа эстрогенов. Применение системы ВЭЖХ с УФ-детектированием и соответствующим этапом предварительного концентрирования является простым и чувствительным способом для анализа.

Ассади и соавторы разработали новый метод микроэкстракции, называемый дисперсионной жидкостно-жидкостной микроэкстракцией (DLLME) [40], [41], [42]. В этом методе используется экстракционный растворитель, плотность которого выше, чем у воды, и дисперсионный растворитель, который может растворяться в обеих фазах, образуя мутный раствор. Благодаря высокой площади контакта между органическим растворителем и пробой воды, время экстракции при DLLME значительно сокращается. DLLME становится популярным методом предварительного концентрирования [43], [44], [45], [46]. Тем не менее экстракционный растворитель, используемый в DLLME, как правило, высокотоксичен и не безопасен для окружающей среды.

В работах [47], [48] описывается новый метод микроэкстракции, который представляет собой DLLME, c интегрированным отверждением плавающей органической капли (DLLME-SFO). В DLLME-SFO использовался растворитель с низкой плотностью и меньшей токсичностью, чтобы нивелировать недостатки DLLME. Этот метод позволяет не только избежать использования токсичного растворителя, но и требует меньшей квалификации персонала за счет более простой техники выполнения по сравнению с SBSE и другими методами. Кроме того, время эксперимента можно сократить с 48 часов до нескольких минут, что делает работу эффективнее. При подходе к точке плавления растворителя, органическая капля может затвердевать при низких температурах.

Сравнительная таблица различных методов анализа и концентрирования гормонов в воде с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии с УФ-детектором представлена в таблице 1.

4. Заключение

Низкие концентрации гормональных загрязнителей (нг/л или пг/л) создают значительные сложности при проведении аналитических исследований. В связи с этим, повышение концентрации гормонов в образцах часто необходимо и проводится с использованием различных методов экстракции. Российские государственные стандарты содержат информацию по требованию к отбору проб и методам контроля качества воды, включая физико-химические и микробиологические показатели, но данные о методах обнаружения гормонов в воде отсутствуют. Таким образом, целесообразно обратиться к существующим зарубежным стандартам, подробно описывающим методики повышения концентрации для анализа гормонов, например, методы 1698 и 539 Агентства по охране окружающей среды США. Оптимальным выбором является следование стандарту 539 для анализа содержания гормонов в питьевой воде. С целью упрощения проведения анализа необходимо применение системы ВЭЖХ с УФ-детектированием и соответствующим этапом предварительного концентрирования, что позволяет разработать простую и чувствительную процедуру для анализа.

The additional file for this article can be found as follows: