1. Введение
Одним из наиболее активно развивающихся направлений в коррекции возраст-ассоциированных патологий является поиск активных молекул, потенциальных геропротекторов — препаратов, способных замедлять старение и увеличивать здоровую продолжительности жизни.
На сегодняшний день в геронтологии, науке о старении организма, уже разработаны критерии потенциальных геропротекторов, ключевым из которых является способность изменять показатели молекулярных, клеточных и физиологических биомаркеров, приближая их к показателям более молодого организма или замедляя прогрессирование возрастных изменений [1], [2]. Однако скорость идентификации геропротекторов остается низкой, что связано с длительностью опытов по оценке продолжительности жизни и необходимостью тестирования большого количества веществ.
В связи с описанными сложностями актуальным является поиск перспективных модельных животных для изучения механизмов старения. Один из таких модельных организмов — рыбы рода Nothobranchius. Представители этого рода, относящегося к отряду Карпозубообразных (Cyprinodontiformes), характеризуются низкой продолжительностью жизни по сравнению с большинством позвоночных животных, небольшими размерами и удобством содержания в лабораторных условиях. Так, наиболее популярные у исследователей представители рода — N. furzeri, N. rachovii и N. guentheri обладают медианой выживаемости 4, 6 и 12 месяцев соответственно, что позволяет снизить временные и финансовые затраты на эксперименты [3], [4].
Сравнение выраженности внешних признаков старения (снижение яркости окраски, искривление позвоночника, эрозия плавников, десквамация чешуи) у самцов Nothobranchius guentheri разного возраста
Процесс старения Нотобранхиусов имеет общие черты с млекопитающими на молекулярном уровне: укорочением теломер, митохондриальную дисфункцию, прогрессирующую потерюбелкового гомеостаза [5], [6]. Сходства имеются и в прогрессировании внешних возрастных изменений. Рыбы рода Nothobranchius стареют постепенно и демонстрируют морфологические изменения, повторяющие многие классические признаки старения высших позвоночных: искривление позвоночника, потеря мышечной массы, снижение подвижности, нейродегенерация с сопутствующими признаками когнитивных нарушений, снижение фертильности и регенеративных способностей, дегенеративные изменения покровов [7], [8], [9], [10] (рисунок 1). Стоит отметить, что характерной особенностью старения рыб являются возрастные изменения покровов, проявляющиеся в спонтанном выпадение чешуи (десквамации), утрате яркости окраски и разрушении плавников.
Перечисленные возрастные изменения в той или иной мере являются морфологическими маркерами старения. Однако, чтобы использовать конкретный признак на практике в качестве биомаркера, необходимо разработать и апробировать систему его количественного измерения, а также определить наличие статистически значимой корреляции между степенью выраженности признака и возрастом.
В работе мы рассмотрели такой внешний маркер старения как эрозия плавников, представляющий собой повреждение тканей на плавниках [11]. Среди остальных биомаркеров его выделяет совокупность преимуществ: возможность измерения in vivo при помощи фотофиксации, возможность оценки измерения у обоих полов, а также удобство дифференцировки наблюдаемых изменений. Как следствие, становится возможным разработать чёткие критерии и создать шкалу изменения признака с возрастом.
В литературе описаны методы измерения степени разрушения плавников рыб. Moutou и соавторы разработали визуальную шкалу (фотографический ключ) для оценки состояния плавников радужной форели (Oncorhynchus mykiss) в открытых водоёмах, используемую для мониторинга здоровья особи [12]. После чего Stejskal и соавторы успешно апробировали вышеописанный метод на евразийском окуне (Perca fluviatilis) [13].
Таким образом, рыбы рода Nothobranchius являются удобной моделью для проведения исследований по оценке действия геропротекторов и определению их влияния на биомаркеры старения и возрастные дегенеративные изменения позвоночных. Однако на данный момент отсутствуют опубликованные визуальные шкалы для оценки выраженности и измерения степени разрушения плавников рыб рода Nothobranchius. В связи с чем целью проведенного исследования стала разработка и апробация визуальной шкалы для оценки степени целостности плавников рыб рода Nothobranchius. Полученные результаты могут быть использованы для создания более сложной модели ранжирования выраженности признаков старения на основе цифровых фотографий.
2. Методы и принципы исследования
Методика визуальной оценки целостности плавников была ранее разработана Moutou и соавторами [13]. В данном исследовании мы адаптировали визуальную шкалу для рыб рода Nothobranchius. Фотографический ключ был составлен на основе снимков рыб, сделанных в лаборатории Постгеномных исследований Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН (ИМБ РАН).
Рыб содержали в индивидуальных контейнерах установки замкнутого водоснабжения (УЗВ) Aquaneering (Aquaneering, Inc, США). Параметры кормления, водной среды и освещения поддерживались в соответствии с протоколом по содержанию рыб рода Nothobranchius [14].
Для разработки шкалы использовали цифровые изображения плавников самцов в возрасте 17–22 месяцев. Были установлены 4 степени эрозии по площади повреждения:
1) 0 — отсутствие или минимальная эрозия (<5%);
2) 1 — слабая (5–30%);
3) 2 — умеренная (31–70%);
4) 3 — сильная (>70%).
Каждому плавнику (спинному, хвостовому, анальному и грудным) присваивали балл от 0 до 3 (рисунок 2). Для грудных плавников рассчитывали среднее арифметическое значение. Общий показатель получали путем суммирования баллов всех плавников с последующим делением на их количество.
Визуальная шкала для оценки степени эрозии плавников N. guentheri
Для валидации шкалы случайным образом было отобрано по 12 особей каждого пола в возрасте 17 месяцев. Оценка состояния плавников проводилась ежемесячно в течение 6 месяцев. Выбор временного интервала обусловлен необходимостью оценки действия геропротекторов на зрелых особях. Полученные данные фиксировали в базе, после чего рассчитывали коэффициент корреляции Пирсона между баллом эрозии плавников и возрастом рыб.
3. Основные результаты
Результаты статистического анализа показали наличие зависимости степени разрушения плавников от возраста. Статистически значимая корреляция отмечалась как у самцов, так и у самок (p < 0,05). Коэффициент корреляции общего балла степени разрушения плавников с возрастом для самок составил 0,57, для самцов 0,6.
В каждой из шести временных точек среднее значение выраженности признака среди особей линейно увеличивалось у представителей обоих полов, что позволяет предположить возможность использования степени разрушения плавников в качестве биомаркера внешних возрастных изменений у N. guentheri (рисунок 3).
Динамика возрастных изменений плавников N. guentheri
Следует отметить, что у самцов наблюдалась более выраженная деградация плавников (средний балл 2,07). Эта особенность объясняется большим развитием и размером плавников у самцов. Литературные данные свидетельствуют, что самцы и самки этих рыб стареют по-разному как на молекулярном, так и на морфологическом уровне.
4. Обсуждение
Мы предполагаем, что разработанную визуальную шкалу можно использовать для оценки обоих полов, однако прямое сравнение их биологического возраста некорректно из-за особенностей полового диморфизма. Согласно литературным данным, у другого представителя рода — N. furzeri — с возрастом значительно снижается способность к восстановлению целостности плавников после повреждения [15], [16].
Предположительно, разрушение плавников при старении может быть связано с возрастным снижением регенеративного потенциала, вызванным иммунным дефицитом и нарушением ангиогенеза. Процесс усугубляется при недостатке витаминов группы B и микроэлементов.
Результаты исследований показывают, что различия в регенеративной способности плавников у молодых и старых особей обусловлены повышенной пролиферативной активностью клеток у молодых животных. С возрастом нарушаются регенеративные процессы, а также происходит деградация коллагеновых волокон, из которых преимущественно состоят плавники рыб. Подобные изменения в эпидермисе и дерме приводят к нарушению целостности покровов. Биологические механизмы этого явления носят многофакторный характер и требуют дополнительных исследований [16]. Аналогичные процессы были описаны у другого модельного объекта — D. rerio [17].
5. Заключение
Мы предполагаем, что адаптированная нами шкала оценки целостности плавников может быть использована в качестве внешнего биомаркера старения и оценки действия потенциальных геропротекторов на рыбах N. guentheri и других представителях рода. Оценку целостности плавников можно автоматизировать, применив машинное обучение, что также повысит точность оценки и сведёт к минимуму ошибку оператора.