1. Введение

Карбонат кальция в виде трех его полиморфных модификаций: кальцита, арагонита и ватерита, встречается не только в составе природных систем, но и в организме человека в составе патогенных биоминеральных агрегатов, таких как холелиты [1], [2], [3]. Изучение генезиса карбоната кальция в желчных камнях представляет большой интерес не только с точки зрения медицины, но и с точки зрения минералогического изучения. Сравнение состава холелитов с природными аналогами будет осуществимо только после исследования возможного сходства, условий кристаллизации и морфологических особенностей карбоната кальция.

Независимо от своего сложного состава, большая часть желчных камней состоит преимущественно из холестерина (может достигать 70%), многих солей кальция, в том числе билирубинат и фосфолипиды, жирные кислоты и соли желчных кислот. В составе конкрементов обнаружено более 20 химических элементов, содержание которых зависит от региона, в котором проживает человек. Важнейшую роль в элементном составе занимают кислород, углерод и кальций, а наименьший вклад вносят такие элементы, как фосфор, азот, сера, хлор, натрий и магний [4], [5], [7], [8].

Существуют три полиморфные модификации карбоната кальция (CaCO3) – стабильный кальцит, нестабильные арагонит и ватерит, которые различаются свойствами (плотностью, растворимостью в воде, пористость и др.) и кристаллической структурой. Формирования определенного полиморфа зависит от способа получения частиц и обусловлено сочетанием многих условий реакции (концентрации исходных реагентов, температуры растворов, значения их pH и т. д.).

Целью настоящей работы являлось исследование особенностей кристаллизации и морфологии карбоната кальция, синтезированного в условиях, приближенных к человеческому организму с примесями различных аминокислот.

В качестве аминокислот были выбраны аспарагиновая и глутаминовая кислоты, цистеин и серин. Аспарагиновая кислота встречается во всех организмах в свободном виде и в составе белков и выполняет роль нейромедиатора в ЦНС. Глутаминовая кислота входит в состав белков всех известных живых организмов. Серин участвует в построении практически всех природных белков. Цистеин играет важную роль в формировании тканей кожи, имеет значение для дезинтаксикационных процессов. Для проведения синтеза аминокислоты были взяты в концентрациях 0,5, 2 и 10 частей от общей концентрации каждого конкретного вещества, содержащегося в плазме крови человека в норме.

2. Методика синтеза

Синтез производили в условиях, приближенных к человеческому организму [9]. Для этого сухую желчь растворяли в дистиллированной воде в концентрации 105 г/л. В полученном модельном растворе проводили синтез CaCO3. Раствор был разделен на две части, в которые были добавлены NaHCO3 и CaCl2*6H2O, соответственно. Во второй раствор добавлялись аминокислоты в концентрациях 0,5, 2 и 10 частей от общей концентрации каждого конкретного вещества, содержащегося в плазме крови человека в норме. Смешивание этих растворов проводилось со скоростью 0,2 мл/с. Кислотность раствора доводили до pH=7.0 после 10 минут смешивания, затем в раствор добавили формалин, чтобы получить формальдегид для консервации желчи. Полученный осадок фильтровался и просушивался. Далее проводили линейку синтезов карбоната кальция в желчи, добавляя в него аминокислоты разной концентрации. Морфологию кристаллов исследовали на оптическом микроскопе Neophot-2, рентгенофазовый анализ проводили на дифрактометре ДРОН-3М на медном Кa-излучении, ИК-спектры снимали на спектрометре ФСН-2202.

3. Экспериментальная часть

На начальном этапе эксперимента был проведен подбор концентрации солей, при которой наблюдался устойчивый рост кристаллов при варьировании времени кристаллизации. Обнаружено формирование кристаллов сферической формы (ватерит) и кубической формы (кальцит), количество и размеры которых сильно отличаются в зависимости от концентрации солей (рисунок 1). Картина кристаллизации, которая наиболее точно соответствует кристаллизации холелитов в организме человека соответствовала концентрации растворов используемых солей в растворе желчи в объеме 500 мл.

На рисунках 2, 3 представлена фотография полученных кристаллов при синтезе с аспарагиновой кислотой. Обнаружено, что – при малой концентрации образуются преимущественно сферы (ватерит) с размерами 27 мкм, в меньшем количестве растут кристаллы кубической формы (кальцит) с размерами от 2 до 36 мкм. С увеличением времени кристаллизации наблюдается рост дендритов (арагонит).

В образцах с концентрацией 2 части от общей концентрации аспарагиновой кислоты в плазме крови человека преобладающей является фаза ватерита, размеры кристаллов которой варьируются в пределах 1-59 мкм, формируются кристаллы кальцита размерами 5-126 мкм и присутствует фаза арагонита. Наибольшая концентрация, которая составляет 10 частей от общей концентрации аспарагиновой кислоты в плазме крови человека, ускоряет образование кристаллов сферической формы, имеющих размеры 2-24 мкм и уменьшает формирование кубической формы кристаллов с размерами 3-22 мкм. Также в небольшом количестве образуются дендриты. По гистограмме видно, что максимальный размер образовавшихся кристаллов наблюдается при 30 минутах смешивания растворов.

На рисунках 4, 5 представлена фотография полученных кристаллов при добавлении глутаминовой кислоты. Здесь при всех концентрациях наблюдается преимущественная кристаллизация фазы ватерита, присутствует фаза кальцита и арагонита. Стоит обратить внимание, что фаза ватерита кристаллизуется не только в форме шарообразных кристаллов, но и может иметь вид различных слоистых, розеткообразных, шестиугольных, линзообразных и таблеткообразных кристаллов, а также их комбинаций.

На гистограмме прослеживается резкий рост размеров кристаллов ватерита при увеличении времени кристаллизации. Аналогичные результаты наблюдались при кристаллизации с серином, однако размеры образующихся кристаллов практически в три раза меньше чем при добавке глутаминовой кислоты.

При кристаллизации с добавкой цистеина также наблюдалась преимущественная кристаллизация фазы ватерита с небольшим содержанием фаз кальцита и арагонита, при этом фаза ватерита, формируется в виде пластин.

Дифрактограммы полученных осадков образцов с используемыми в эксперименте аминокислотами представлены на рисунках 10, 11, 12 и 13.  Фазовый анализ показал, что при кристаллизации с добавкой аспарагиновой кислоты преобладающей является фаза ватерита со структурными элементами арагонита и кальцита. Аналогичные результаты получены и для других аминокислот (рисунки 11, 12 и 13). Исключением является образец с двойной концентрацией серина, у которого преобладает фаза арагонита. При этом наблюдались свои особенности, связанные с уменьшением либо увеличением содержания фазы арагонита при варьировании концентрации аминокислот. Так, при добавках серина и цистеина в максимальной концентрации содержание фазы арагонита возрастает, тогда как увеличение концентрации глутаминовой кислоты приводит к уменьшению содержания фазы арагонита.

Анализ ИК - спектров подтвердил присутствие фаз ватерита (1070 см-1, 745 см-1), кальцита (1471 см-1, 880 см-1) и арагонита (1080 см-1) для всех используемых в эксперименте аминокислот (рисунок 14). Обнаружены изменения интенсивности полос поглощения при варьировании типа и концентрации аминокислоты. Так, с увеличением концентрации серина, наблюдается уменьшение интенсивности пиков поглощения, соответствующих кальциту и ватериту. Увеличение концентрации аспарагиновой кислоты приводит сначала к уменьшению, а затем к увеличению интенсивности полос поглощения кальцита, при двойной концентрации наблюдается появление фазы арагонита и увеличение интенсивности полос поглощения  фазы ватерита. При увеличении концентрации глутаминовой кислоты получены результаты аналогичные кристаллизации с добавками аспарагиновой кислотой. На спектрах с примесями цистеина при двойной концентрации наблюдалось сначала уменьшение, и затем небольшой рост содержания кальцита и ватерита при увеличении концентрации в растворе. Поскольку кристаллизация проводилась в присутствие желчи, то на ИК-спектрах обнаруживались полосы поглощения характерные холестерину (1462 см-1) и билирубину (989 см-1) [10]. Известно, что в состав желчи входит 95-97% воды и 3-5% сухого остатка. Кроме желчных кислот, в составе присутствуют и другие липиды (холестерин и фосфолипиды), также присутствуют желчные пигменты, такие как билирубин и продукты его преобразования, белки и микроэлементы.

Результаты ИК- спектроскопии подтвердили данные рентгенофазового анализа и показали зависимость формирующихся фаз карбоната кальция от типа и концентрации добавок используемых в эксперименте аминокислот.

4. Заключение

Таким образом, проведенные исследования по влиянию аминокислот – аспарагиновой и глутаминовой кислот, серина и цистеина на кристаллизацию желчных камней в условиях, приближенных к человеческому организму показали, что при всех используемых в эксперименте концентрациях и временах кристаллизации происходит формирование кристаллов ватерита, кальцита и арагонита, количество и размеры которых сильно отличаются в зависимости от концентрации и времени кристаллизации. При этом независимо от типа аминокислоты преобладающей фазой является фаза ватерита. Установлено, что добавки глутаминовой кислоты при одинаковых условиях кристаллизации приводят к резкому росту формирующихся кристаллов ватерита и кальцита. 

The additional file for this article can be found as follows: