1. Введение
Более чем три десятилетия назад появились первые разработки двухслойного и биосовместимого дермального скаффолда на основе бычьего коллагенового матрикса, который успешно индуцировал синтез неодермы. Эта новая биоконструкция произвела настоящую революцию в современной ожоговой практике
[1][2][3][3][4]
Несмотря на значительный прогресс в фундаментальных и прикладных исследованиях в области клеточной и тканевой инженерии, нет единых критериев, которые бы отражали биосовместимость скаффодов с культивируемыми клеточными линиями, в том числе с клеточными линиями кожи
[5][6][7]
В связи с этим цель исследования – предложить критерии биосовместимости дермальных фибробластов и скаффолдов различной химической природы и пространственной организации – G-DERM, Cytodex 3, Transwell.
2. Методы и принципы исследования
В качестве тест-системы была использована клеточная линия дермальных фибробластов кожи человека 3 пассажа. Первичная культура получена методом экспланта кожного лоскута размерами не более 1,0×5,0 см, иссеченного из области груди (область ареола). Культивирование проводили в стерильных чашках Петри (ТРР, Швейцария) и флаконах объемом 25 см2Missing Mark : sup (ТРР, Швейцария), в питательной среде RPMI-1640 (Панэко, Россия) с 10% сывороткой эмбрионов телят (HyClonе, США), гентамицином (Панэко, Россия) в условиях 5% СО2Missing Mark : sub при температуре +37°С. Оценку количества клеток проводили с помощью анализа исключения трипанового синего на автоматическом счетчике клеток (BioRad, США).
«Transwell» – мембраны из тетрафторэтилена (ПТФЭ) с коллагеновым покрытием, который используется в качестве вставки для культуральных планшетов. Толщина мембраны 10 мкм, диаметр 24 мм, диаметр пор 0,4 мкм.; «G-DERM» – биопластический материал из биополимера на основе гидроколлоида гиалуроновой кислоты и адгезивного пептидного комплекса; «Cytodex 3» - гранулы диаметром 300мкм, образованные путем химического связывания тонкого слоя денатурированного коллагена с поперечно-сшитым декстрановым матриксом сферической формы в гидрогеле. Экспериментальные группы в зависимости от скаффолда на который заселяли дермальные фибробласты условно обозначали
Анализ роста, количества живых клеток и фотофиксацию проводили на флуоресцентном инвертированном микроскопе «Axio Vert. A1 FL» (Carl Zeiss, Германия) с цифровой цветной видеокамерой Axiocam 105 при увеличении ок10 х об20. Рассчитывали индекс пролиферации и пролиферативный потенциал.
Для определения характера роста фибробластов, клетки выращивали на покровном стекле с адгезивным покрытием Polysine (Thermo Fisher Scientific, США), фиксировали 10% формалином, окрашивали гематоксилином Карацци и водно-спиртовым раствором эозина (Вiovitrum, Россия) согласно разработанному в НИЦ ФППББ оптимизированному протоколу, заключали в среду Immu-Mount (Thermo Fisher Scientific, США). Для морфологического анализа препараты оцифровывали на сканере «Pannoramic Deck» (3DHISTECH, Венгрия) с программным обеспечением Zeiss (Германия).
Анализ клеточного цикла методом проточной цитофлуориметрии проводили как описано ранее (Pozarowski, Darzynkiewicz, 2004). Объем клеток 5*105Missing Mark : sup в одном аналите предварительно фиксировали в 70% охлажденном этаноле. В работе использовали флуорохром ДНК пропидий йодид (PI) (50 мкг/мл), РНКазу (100 мкг/мл). Анализ и интерпретацию данных выполняли на мультилазерной (мультиплексной) диагностической системе проточной цитофлуориметрии CyFlowSpace (Partec, Германия) с сопряженным программным обеспечением FlowMax, при длине волны 536 нм. Для оценки доли клеток в соответствующих фазах клеточного цикла (G0/G1, S и G2/M) анализировали гистограммы частоты содержания ДНК в клетках.
Для анализа путей клеточной гибели использовали двойной флуресцентный краситель (FITS) к Annexin V и 7-AAD (BD Bioscientices, США). Живые клетки отрицательны по Annexin V-/7-AAD-, клетки на ранней стадии апоптоза проявляют одиночное флуоресценцирование положительное свечение – Annexin V+/7-AAD-, а клетки на поздней стадии апоптоза и клетки в состоянии некроза проявляют двойную положительную флуоресценцию – Annexin V+/7-AAD+, Annexin V- 7AAD+ – соответственно.
При анализе, обработке и представлении данных использовалось программное обеспечение Prism 8.0.1 (Graphpad, США). Для каждой выборки было рассчитано среднее значение и стандартное отклонение. Различия величин тестируемых показателей в контрольной и экспериментальной группе оценивали с помощью попарной статистики, используя t-критерий Стьюдента. Различия считались достоверными при уровне значимости р<0,05.
3. Результаты и обсуждение
На этапе выделения первичной клеточной культуры отмечаются популяции фибробластов разной степени дифференцировки - клетки среднего и крупного размера, веретеновидной и плащевидной формы с отростками I-го и II-го порядка. В слабо базофильной эктоплазме располагаются пересекающиеся нитевидные структуры и включения. Ядро овальной формы с чётким контуром, количество ядрышек от 2 до 4-х.
В контрольных образцах через 48 часов инкубации отмечена деконденсация хроматина, как морфологический критерий секреторной активности, активации обменных процессов с внеклеточным матриксом. Отростки фибробластов веретеновидной формы значительно длиннее по сравнению с таковыми у фибробластов округлой формы. На поверхности отдельных фибробластов присутствовали инвагинации, которые являются признаком экзо- или эндоцитозного транспорта. Межклеточное пространство заполнено умеренным количеством ВКМ (внеклеточного матрикса) с немногочисленными тонкими волокнами.
После формирования монослоя большинство фибробластов метаболически активны, веретеновидной формы, ориентированные параллельно или волнообразно вокруг центра колониеобразования. Подобная картина монослоя отражает различную степень организации и ориентации цитоскелета фибробластов, который обеспечивает динамическое изменение клетки в ответ на меняющееся микроокружение. В ходе анализа эффективности колониеобразования отмечено, что колонии, сформированные дермальными фибробластами, отличались друг от друга: рыхлые колонии состоят из разных по величине, разобщенных, хаотично ориентированных, полиморфных фибробластов с большим количеством отростков; плотные колонии – преобладает веретеновидная форма, клетки упорядоченно расположены, тесно прилежат друг к другу; смешанные колонии - из веретеновидных и полиморфных фибробластов.
Фибробласты клеточной линии после заселения на скаффолды удлиненной формы, с распластанной цитоплазмой, плотно прилегающие к пластику культурального флакона (активные фибробласты). Все культуры сформировали монослой в равные сроки на - 7 сутки. Фибробласты экспериментальной группы
В группах CulTw и CulGD формирование конфлюэнтного слоя клеток отмечено в течение 2 недель. В группе CulCyt рост клеточной линии неравномерный с появлением единичных фибробластов на 5 и 7 день культивирования. Полное заселение скаффолда наблюдалось с 13 по 21-е сутки культивирования (рис. 1А) с частичным прикреплением фибробластов к микроносителю (рис. 1Б), что определяет низкую скорость роста клеток на поверхности микросфер гидрогелевого скаффолда Cytodex 3.
Клеточная линия дермальных фибробластов группы CulCyt
В группе CulTw дермальные фибробласты, с 2 по 15-й день культивирования формировали монослой, процент живых клеток составил 97%. Визуализация прикрепившихся на G-Derm клеток затруднена в связи с особенностями структуры матрицы (рис 2А)процент живых клеток 9%.
Клеточная линия дермальных фибробластов группы G-Derm
Методом проточной цитофлуориметрии выявлены различия в распределении фибробластов по фазам клеточного цикла в зависимости от химико-физических свойств и пространственной организации структур скаффолдов. Так, в группе CulTw 27% фибробластов полиплоидны 2n4c (S-стадия), 27% в стадии митоза – G2-M-период, в стадии пролиферативного покоя 47% диплоидных клеток (2n2c) - G0-G1-стадия.
В группе CulGD 12% фибробластов полиплоидны 2n4c (S-стадия), 45% в стадии митоза – G2-M-период и 43% диплоидных клеток (2n2c) – G0-G1-стадия пролиферативного покоя (рис. 3).
Показатели клеточного цикла клеточной линии дермальных фибробластов группы CulTw (А) и CulGD (Б)
[8]
Методом проточной цитофлуориметрии выявлено, в экспериментальной группе CulTw 9% клеток проявляют признаки ранней стадии апоптоза (Annexin V+/7-AAD-), около 50% клеток на поздней стадии апоптоза (Annexin V+/7-AAD+), 20% клеток, которые погибают по пути клеточного некроза (Annexin V- 7AAD+) (рис. 4). В группе CulGD 1% клеток на ранней стадии апоптоза (Annexin V+/7-AAD-), 58% на поздней стадии апоптоза (Annexin V+/7-AAD+), и 5% клеток, погибают по пути клеточного некроза (Annexin V- 7AAD+).
Реализация ПКГ фибробластов
[9][10][11]
Классические причины, приводящие к некрозу клетки - гипертермия, ингибирование окислительного фосфорилирования, гликолиза или цикла Кребса, истощение НАД+ и АТФ, гипоксия, с активацией гена BNIP3, лизосомальных кальций-зависимых протеаз – кальпаин, катепсин, протеасомы в меньшей мере каспаз, нарушением целостности мембран, ионного гомеостаза [12], [13], [14]. В нашем эксперименте, по всей видимости, пусковыми механизмами являются процессы, связанные с дисфункцией митохондрий и нарушением ионного гомеостаза.
4. Заключение
Таким образом, результаты проведенного комплексного анализа по определению биосовместимости скаффолдов Cytodex 3, Transwell, G-DERM которые отличаются химическим составом и пространственной организацией, с клеточной линией дермальных фибробластов выявил: веретеновидная форма и большее количество отростков, высокая кинетика роста культуры фибробластов, большой процент жизнеспособных клеток (более 95%) и бóльшее число фибробластов CD90+ (мезенхимный маркер) характерен для фибробластов растущих на Transwell и G-DERM. При этом клеточная линия фибробластов, заселенная на G-DERM с более высокой митотической активностью (G2-M-период), с бóльшим числом фибробластов CD90+ (мезенхимный маркер 89%), основной путь гибели – апоптоз (Annexin V+/7-AAD- и Annexin V+/7-AAD+).