АКТУАЛЬНОСТЬ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПРОИЗВОДНЫХ БАРБИТУРОВОЙ КИСЛОТЫ ПРИ ХИМИКО-ТОКСИКОЛОГИЧЕСКОМ АНАЛИЗЕ НА ПРИМЕРЕ ЦИКЛОБАРБИТАЛА

АКТУАЛЬНОСТЬ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПРОИЗВОДНЫХ БАРБИТУРОВОЙ КИСЛОТЫ ПРИ ХИМИКО-ТОКСИКОЛОГИЧЕСКОМ АНАЛИЗЕ НА ПРИМЕРЕ ЦИКЛОБАРБИТАЛА

Научная статья

Петрова О.С.^1, *, Матвеева Л.В.², Сухова Н.А.³

¹ ORCID: 0000-0002-4458-7953,

¹ Новгородский государственный университет имени Ярослава Мудрого, Великий Новгород, Россия;

^{2, 3} Новгородское бюро судебно-медицинской экспертизы, Великий Новгород, Россия

* Корреспондирующий автор (yalome[at]mail.ru)

Аннотация

Сохраняется актуальность химико-токсикологического анализа на производные барбитуровой кислоты, так как отравления ими встречаются нередко, и в смеси с другими токсикологически важными препаратами [4], [5], [6]. Основу экспертной оценки отравления производными барбитуровой кислоты составляет качественное определение препарата в организме человека с учетом обстоятельств дела и клинической картины отравления, однако имеется возможность количественной оценки обнаруженных препаратов и их метаболитов. С целью улучшения диагностики отравления производными барбитуровой кислоты составлена и оптимизирована четкая схема химико-токсикологического анализа при судебно-химических экспертных исследованиях биообъектов.

Ключевые слова: производные барбитуровой кислоты, химико-токсикологический анализ. 

RELEVANCE OF DETERMINATION OF BARBITURIC ACID DERIVATIVES BY CHEMICAL AND TOXICOLOGICAL ANALYSIS ON EXAMPLE OF CYCLOBARBITAL

Research article

Petrova O.S.^1, *, Matveeva L.V.², Sukhova N.A.³

¹ ORCID: 0000-0002-4458-7953,

¹ Yaroslav-the-Wise Novgorod State University, Velikiy Novgorod, Russia;

^{2, 3} Novgorod Forensic Bureau, Velikiy Novgorod, Russia

* Corresponding author (yalome[at]mail.ru)

Abstract

The relevance of the chemical and toxicological analysis for derivatives of barbituric acid are due to common poisoning with these substances and in a mixture with other toxicologically important drugs [4], [5], [6]. The basis of the expert assessment of poisoning with derivatives of barbituric acid is a qualitative determination of the drug in the human body, considering the circumstances of the case and the clinical picture of poisoning; however, it is possible to quantify the detected drugs and their metabolites. A transparent scheme of chemical-toxicological analysis was compiled and optimized in forensic chemical expert studies of biological objects to improve the diagnosis of poisoning with derivatives of barbituric acid.

Keywords: derivatives of barbituric acid, chemical, and toxicological analysis. 

Введение

С каждым годом расширяется ассортимент веществ, используемых молодыми людьми с целью воздействия на центральную нервную систему. Среди наркотических веществ, употребляемых наркоманами, наиболее часто используются синтетические аналоги опиатов и курительные смеси на основе синтетических каннабиноидов, часто в комбинации с этанолом. Первый способ лечения наркомании, который приходит в голову самому наркоману – облегчение абстиненции с помощью различных лекарственных средств [3]. Самым подходящими с их точки зрения являются снотворные средства, которые они готовы употреблять в количествах, превышающих высшую суточную дозу. Примером комбинированного снотворного препарата является реладорм – таблетки, содержащие циклобарбитал и диазепам – способен сформировать настоящую зависимость [4]. Кроме того, он при массивном использовании, а именно так его применяют наркоманы, вызывает поражение головного мозга – энцефалопатию.

В настоящее время остается актуальным определение производных барбитуровой кислоты в смеси с наркотическими веществами при химико-токсикологическом анализе. Указанное обстоятельство требует подобрать оптимальную схему исследования, позволяющую, не ухудшая качество, значительно снизить сроки проведения химико-токсикологического анализа.

В практике ГОБУЗ «Новгородское Бюро судебно-медицинской экспертизы» встретился случай злоупотребления таблетками «Реладорм», содержащими диазепам и циклобарбитал. Из реанимационного отделения больницы был доставлен больной, со слов родственников стало известно, что он принял таблетки анальгина и димедрола, после чего отметил ухудшение самочувствия и был госпитализирован. Для проведения химико-токсикологического анализа были направлены кровь, моча и промывные воды желудка, а также таблетки (14 штук), обнаруженные в кармане больного, которые исследовались в первую очередь, так как предварительная реакция мочи и промывных вод на производные пиразолона (с раствором хлорида окисного железа) была отрицательной.

В ходе эксперимента было решено разработать схему химико-токсикологического анализа: изолирование, очистку, скрининг, качественный и количественный анализ для исследуемых биожидкостей и неизвестных таблеток. Для анализа было предоставлено: 100 мл мочи, 10 мл крови, 100 мл промывных вод из желудка, неизвестные таблетки 14 штук (таблетки белого цвета, плоской округлой формы, диаметром 7 мм, весом 110 мг, толщиной 1,5 мм).

Для иммунохроматографического определения использовали тест-полоски на фенциклидин серия №100804, трициклические антидепрессанты серия №240801, морфин серия №50810, бензодиазепины серия №60810, амфетамин серия №30810, метамфетамин серия №80804, марихуану серия №20810, метадон серия №70810, кокаин серия №40810, барбитураты №90810.

В чистую емкость вносили анализируемый образец мочи (1,5 мл). Погружали тест-полоски строго вертикально концом со стрелками в мочу на 30 секунд. Извлекали и через 5минут наблюдали одну розовую полосу на тест-полосках для барбитуратов и бензодиазепинов. На других тест-полосках наблюдали по две розовые полосы. Делали вывод, что в анализируемом образце предположительно присутствуют производные барбитуровой кислоты, 1,4-бензодиазепина.

Далее проводили пробоподготовку: 10 мл крови помещали в колбу, прибавляли 20 мл 96% этилового спирта, подкисленного насыщенным раствором щавелевой кислоты, до рН=2 и нагревали на кипящей водяной бане с обратным холодильником 50 минут. После охлаждения содержимое колбы фильтровали в фарфоровую чашку и выпаривали досуха на водяной бане. Сухой остаток обрабатывали 20 мл теплой воды и проводили экстракцию органическими растворителями: при рН=2 и рН=9 – хлороформом, при рН=13 – эфиром. При аналогичных значениях рН проводили прямую экстракцию для мочи и промывных вод. Щелочные извлечения для каждого объекта объединяли соответственно. Растворители испаряли при комнатной температуре. Сухие кислые остатки растворяли в 3 мл хлороформа каждый. Параллельно исследовали неизвестные таблетки, предварительно растворив их в 5 мл хлороформа и профильтровав.

Полученные хлороформные вытяжки экстрагировали 0,1 н раствором едкого натра и центрифугировали – водные фазы отбирали пипеткой, промывали хлороформный слой водой очищенной дважды по 5 мл. Промывные воды также отбирали пипеткой, присоединяя их к основной водной фазе, подкисляли щавелевой кислотой до рН=2 и дважды по 5 мин экстрагировали хлороформом порциями по 20 мл. Хлороформные вытяжки объединяли и доводили до объема 50 мл (V₁).

0,3 мл хлороформных извлечений и раствора неизвестной таблетки наносили с помощью капилляра в виде точки на стартовую линию трех хроматографических пластинок Sorbfil. На линию старта наносили в качестве свидетелей в одну точку последовательно по 0,2 мл (1мг в 1мл этанола) барбитал, фенобарбитал, этаминал-натрий, барбамил, и 0,2 мл (1мг в 1мл хлороформа) бензонал, циклобарбитал, диазепам. Полученные пятна диаметром не более 0,5 см подсушивали.

Хроматографирование проводили в следующих системах растворителей: хлороформ – н-бутанол – 25 % раствор аммиака (70:40:5), хлороформ – ацетон (9:1), изопропанол – хлороформ – 25% раствор аммиака (90:90:20). Камеры предварительно насыщали системой растворителей в течение 60 мин. Длина пробега фронта растворителя – 10 см. Время хроматографирования – 45 мин. После подсушивания при комнатной температуре до полного удаления растворителей пластинки равномерно опрыскивали 0,02% раствором дифенилкарбазона в хлороформе, а затем 2,5% раствором сульфата ртути [2].

На первой пластине в зоне нанесения свидетелей наблюдали пятна сиреневато-фиолетового цвета с R_f: барбитал – 0,22, фенобарбитал – 0,21, бензонал – 0,39, барбамил – 0,29, этаминал-натрия – 0,35, циклобарбитал – 0,31. В зоне нанесения исследуемых извлечений и неизвестной таблетки наблюдали пятна сиреневато-фиолетового цвета с R_f – 0,31.

На второй пластине в зоне нанесения свидетелей наблюдали пятна сиреневато-фиолетового цвета с R_f: барбитал – 0,70, фенобарбитал – 0,49, бензонал (2 пятна) – 0,49 и 0,61, барбамил – 0,85, этаминал-натрия – 0,94, циклобарбитал – 0,56. В зоне нанесения исследуемых извлечений и неизвестной таблетки наблюдали пятна сиреневато-фиолетового цвета с R_f –0,56.

На третьей пластине в зоне нанесения свидетелей наблюдали пятна сиреневато-фиолетового цвета с R_f: барбитал – 0,65, фенобарбитал – 0,44, бензонал – 0,54, барбамил – 0,80, этаминал-натрия – 0,89, циклобарбитал –0,59. В зоне нанесения исследуемых извлечений и неизвестной таблетки наблюдали пятна сиреневато-фиолетового цвета с Rf – 0,59.

Затем эти пластины обесцвечивали в токе теплого воздуха и проявляли реактивом Драгендорфа. В зоне нанесения свидетелей наблюдали пятна оранжевого цвета с R_f: на первой пластине – 0,45; на второй пластине – 0,65; на третьей – 0,70 для диазепама. В зоне нанесения исследуемых извлечений и неизвестной таблетки наблюдали пятна оранжевого цвета с R_f: на первой пластине – 0,45; на второй пластине – 0,65; на третьей – 0,70.

По результатам экспериментальной части можно сделать вывод, что системы хлороформ-н-бутанол-25 % раствор аммиака (70:40:5), хлороформ-ацетон (9:1), используемые в тонкослойной хроматографии, являются оптимальными для определения производных барбитуровой кислоты, так как пятна для веществ-свидетелей проявляются более четко и разгоняются на разные уровни.

Для исследуемых биожидкостей проводили качественное и количественное определение неизвестного токсиканта методом – спектрофотометрия в УФ-области: по 1 мл (V₂) исследуемых кислых хлороформных извлечений помещали в фарфоровые чашки, растворитель испаряли, а сухие остатки растворяли в 4 мл (V₃) боратного буфера (pH=9). Снимали спектры поглощения в области длин волн 220-300 нм на спектрофотометре СФ-46 с толщиной слоя кюветы 10 мм, раствор сравнения – боратный буфер (pH=9) [1], [7]. Затем в кюветы добавляли по 2 капли насыщенного раствора едкого натра (рН=13) и после тщательного перемешивания вновь снимали спектр поглощения в том же интервале длин волн. Далее в кюветы вносили по одной капле концентрированной соляной кислоты для достижения значения рН=2, и вновь снимали спектр в области длин волн 220-300нм (см. таблицу 1).

 

Таблица 1 – Результаты спектрофотометрического определения биообъектов

Длина волны	Кровь			Моча			Промывные воды
	рН=9	рН=13	рН=2	рН=9	рН=13	рН=2	рН=9	рН=13	рН=2
220 224 228 232 236 240 244 248 252 256 260 264 268 272 276 280 300	1,730 1,600 1,630 1,720 1,800 1,840 1,710 1,450 1,110 0,800 0,590 0,480 0,400 0,350 0,325 0,300 0,215	1,610 1,530 1,410 1,320 1,240 1,180 1,170 1,240 1,300 1,360 1,310 1,250 1,170 1,080 1,015 0,950 0,900	2,030 1,740 1,450 1,240 1,100 0,990 0,900 0,820 0,760 0,730 0,710 0,680 0,650 0,620 0,590 0,570 0,460	0,870 0,740 0,860 1,040 1,165 1,225 1,155 1,015 0,900 0,805 0,720 0,645 0,580 0,515 0,450 0,390 0,250	0,780 0,710 0,640 0,560 0,480 0,410 0,370 0,395 0,470 0,535 0,470 0,415 0,355 0,300 0,245 0,200 0,100	0,990 0,860 0,760 0,680 0,600 0,520 0,450 0,370 0,295 0,200 0,175 0,150 0,120 0,100 0,085 0,065 0,045	1,650 1,500 1,360 1,200 1,450 1,710 1,310 0,970 0,760 0,590 0,480 0,420 0,390 0,360 0,330 0,300 0,155	1,350 1,280 1,235 1,180 1,140 1,080 1,015 1,035 1,090 1,170 1,130 1,055 0,980 0,920 0,850 0,800 0,750	1,800 1,540 1,310 1,085 0,900 0,750 0,650 0,580 0,540 0,520 0,520 0,520 0,500 0,490 0,460 0,440 0,270

  Одновременно снимали спектр поглощения циклобарбитала при тех же условиях (см. рисунок 1).

Рис. 1 – УФ-спектр поглощения циклобарбитала при разных значениях рН

 

Наблюдались максимумы поглощения для циклобарбитала и исследуемых извлечений: при рН=9 – 240 нм, рН=13 – 256 нм. При рН=2 каких-либо максимумов не наблюдали.

Для количественного определения измеряли оптическую плотность на спектрофотометре СФ-46 с толщиной слоя кюветы 10 мм при длине волны 260 нм, раствор сравнения – боратный буфер. Были получены результаты:

рН=9 – D_кровь=0,263, D_моча=0,530, D_{промывные воды}=0,230;

рН=13 – D_кровь=0,265, D_моча=0,540, D_{промывные воды}=0,255.

Для расчета пользовались значениями удельного показателя поглощения (Е^1%_1см), который вычисляли по формуле (см. таблицу 2):

    (1)

где  С – концентрация исследуемого вещества в %, l – толщина поглощающего слоя в см, Δ D = D_рН=13 – D_рН=9.

Из однородных результатов, используя статистическую обработку, определяли среднее арифметическое значение удельного показателя поглощения, которое составило Е^1%_1см = 410.

Расчет концентрации циклобарбитала (Х) в исследуемых объектах производили по формуле:

     (2) где ∆D = D_рН=13 – D_рН=9, V₁ – общий объем хлороформного извлечения, мл, V₂ – аликвотная часть хлороформного извлечения, взятого на исследование, мл, V₃ – разведение, мл, Е^1%_1см – удельный показатель поглощения, равный 410, V – объем биожидкости, мл.  

Таблица 2 – Результаты количественного определения

Концентрация циклобарбитала, мг%	D при рН=9	D при рН=13	Е1%1см
0,4 0,6 0,8 0,10 0,15 0,20	0,192 0,286 0,396 0,490 0,712 0,947	0,030 0,040 0,066 0,075 0,100 0,127	405 410 412 415 408 410

 

Концентрация циклобарбитала по формуле (2) равна: в крови 0,9 мг%; в моче 0,4 мг%, в промывных водах 1,2 мг%.

По 1 мл кислых извлечений и 0,1 мл хлороформного раствора таблетки переносили в чистые флаконы и испаряли растворитель досуха. К сухим остаткам добавляли 100 мкл этилацетата и по 1 мкл этилацетатных растворов исследовали на хромато-масс-спектрометре Agilent7890/5975N EI/PCI с капиллярной колонкой НР-5 MS длиной 30 м и диаметром 0,25 мм. Начальная температура колонки 100°С, скорость подъема температуры 25°С в минуту до 300°С. Время эксперимента – 26 минут.

По результатам исследования были идентифицированы пики, соответствующие по времени удерживания и масс-спектрам циклобарбиталу и диазепаму в крови, моче, промывных водах желудка, неизвестной таблетке.

Стоит отметить, что газовая хроматография с масс-селективным детектированием (ГХ/МС) получила широкое распространение в судебно-химическом и химико-токсикологическом анализе как высокоспецифичный, чувствительный и достаточно экспрессный метод.

Заключение

С целью сокращения времени химико-токсикологического анализа биожидкостей при отравлении производными барбитуровой кислоты и смешанных отравлениях, в том числе производными барбитуровой кислоты, предложено использовать комбинацию принципиально разных методов, и получение по каждому из них положительных результатов. При этом выполняется основное правило – проведение химико-токсикологического анализа как минимум двумя методами, причем один из этих методов используется для предварительного исследования, а другой – для подтверждающего исследования. Также оптические и хроматографические, в совокупности с масс-селективным детектированием, методы позволяют открывать не только производные барбитуровой кислоты, но и другие токсикологически важные соединения одновременно.

Конфликт интересов Не указан.

Conflict of Interest None declared.

Список литературы / References

1. Вергейчик Т.Х. Токсикологическая химия: учебник / Т. Х. Вергейчик. – М.: МЕДпресс-информ, 2009. – С. 142-157
2. Внуков В.И. Тонкослойная хроматография при исследовании наркотических средств [Электронный ресурс] / В.И, Внуков, Д.В. Кайргалиев, Д.В. Васильев и др. // Современные проблемы науки и образования. – 2015. – №1-2; URL: http://science-education.ru/ru/article/view?id=19878 (дата обращения: 14.02.2020).
3. Ермаков М.Г. Психоактивные свойства сильнодействующих и ядовитых веществ: уголовно-правовой аспект / М.Г. Ермаков // Психопедагогика в правоохранительных органах. – 2012. – №4 (51). – С. 10-13
4. Захарченко М.Ю. Барбитураты, бензодиазепины, анаболические стероиды: история создания, действие, анализ: учебно-справочное пособие / М.Ю. Захарченко, И.Н. Мельников, Д.В. Кайргалиев; под ред. С. Я. Пичхидзе // Саратов: КУБиК, 2015. – 189 с.
5. Илларионова Е.А. Химико-токсикологический анализ снотворных лекарственных средств: учебное пособие / Е.А. Илларионова, И.П. Сыроватский; ФГБОУ ВО ИГМУ Минздрава России, кафедра фармацевтической и токсикологической химии. – Иркутск: ИГМУ, 2016 – 32 с.
6. Кайргалиев Д.В. Современные возможности экспертного исследования барбитуратов в сложных смесях / Д.В. Кайргалиев, И.Н. Мельников, Д.В. Васильев // Технико-криминалистическое обеспечение раскрытия и расследования преступлений: сборник тезисов и статей Международной научно-практической конференции, 19 октября 2018 г. / [составитель: Васильев Д. В.]. – Волгоград: Перископ-Волга, 2018. – С. 119-122
7. Калетина Т.И. Токсикологическая химия. Аналитическая токсикология: учебник / Т.И. Калетина; под ред. Р.У. Хабриева, Н.И. Калетиной. – М.: ГЭОТАР-Медиа, 2010. – С. 472-484
8. Киричек А.В. Исследование производных барбитуровой кислоты в застарелых пятнах крови на тканях / А.В. Киричек, А.Э. Шабалина, Л.А. Рассинская // Судебно-медицинская экспертиза. – М., 2017 – №2. – С. 27-29.
9. Петрова О.С. Токсикологическая химия: учебно-методическое пособие / О.С. Петрова, Г.А. Антропова // НовГУ им. Ярослава Мудрого. – Великий Новгород, 2012. – С. 49-54
10. Clarke`s analysis of drugs and poisons / Ed.Moffat A.C., Osselton M.D., Widdop B.– London, Pharmaceutical Press, 2011. – Fourth Edition. – Р. 1177

Список литературы на английском языке / References in English

1. Vergejchik T.H. Toksikologicheskaya himiya: uchebnik [Toxicological chemistry: textbook] / T. H. Vergejchik. – M.: MEDpress-inform, 2009. – Р. 142-157 [in Russian]
2. Vnukov V.I. Tonkoslojnaya hromatografiya pri issledovanii narkoticheskih sredstv [Thin-layer chromatography in the study of narcotic drugs] [Electronic resource] / V.I, Vnukov, D.V. Kajrgaliev, D.V. Vasil'ev et al // Sovremennye problemy nauki i obrazovaniya. – 2015. – №1-2; URL: http://science-education.ru/ru/article/view?id=19878 (accessed: 14.02.2020).
3. Ermakov M.G. Psihoaktivnye svojstva sil'nodejstvuyushchih i yadovityh veshchestv: ugolovno-pravovoj aspekt [Psychoactive properties of potent and toxic substances: criminal law aspect] / M.G. Ermakov // Psihopedagogika v pravoohranitel'nyh organah. – 2012. – №4 (51). – P. 10-13
4. Zaharchenko M.Yu. Barbituraty, benzodiazepiny, anabolicheskie steroidy: istoriya sozdaniya, dejstvie, analiz: uchebno-spravochnoe posobie [Barbiturates, benzodiazepines, anabolic steroids: history of creation, action, analysis: educational reference guide] / M.Yu. Zaharchenko, I.N. Mel'nikov, D.V. Kajrgaliev; pod red. S. Ya. Pichkhidze // Saratov: KUBiK, 2015. – 189 р. [in Russian]
5. Illarionova E.A. Himiko-toksikologicheskij analiz snotvornyh lekarstvennyh sredstv: uchebnoe posobie [Chemical and Toxicological analysis of sleeping pills: textbook] / E.A. Illarionova, I.P. Syrovatskij; FGBOU VO IGMU Minzdrava Rossii, kafedra farmacevticheskoj i toksikologicheskoj himii. – Irkutsk: IGMU, 2016 – 32 р. [in Russian]
6. Kajrgaliev D.V. Sovremennye vozmozhnosti ekspertnogo issledovaniya barbituratov v slozhnyh smesyah [Modern possibilities of expert research of barbiturates in complex mixtures] / D.V. Kajrgaliev, I.N. Mel'nikov, D.V. Vasil'ev // Tekhniko-kriminalisticheskoe obespechenie raskrytiya i rassledovaniya prestuplenij: sbornik tezisov i statej Mezhdunarodnoj nauchno-prakticheskoj konferencii, 19 oktyabrya 2018 g. / [sostavitel': Vasil'ev D. V.]. – Volgograd: Periskop-Volga, 2018. – Р. 119-122 [in Russian]
7. Kaletina T.I. Toksikologicheskaya himiya. Analiticheskaya toksikologiya: uchebnik [Toxicological chemistry. Analytical toxicology: textbook] / T.I. Kaletina; pod red. R.U. Habrieva, N.I. Kaletinoj. – M.: GEOTAR-Media, 2010. – Р. 472-484 [in Russian]
8. Kirichek A.V. Issledovanie proizvodnyh barbiturovoj kisloty v zastarelyh pyatnah krovi na tkanyah [Study of barbituric acid derivatives in old blood spots on tissues] / A.V. Kirichek, A.E. Shabalina, L.A. Rassinskaya // Sudebno-medicinskaya ekspertiza. – M., 2017 – №2. – Р. 27-29 [in Russian]
9. Petrova O.S. Toksikologicheskaya himiya: uchebno-metodicheskoe posobie [Toxicological chemistry: educational and methodical manual] / O.S. Petrova, G.A. Antropova // NovGU im. Yaroslava Mudrogo. – Velikij Novgorod, 2012. – Р. 49-54 [in Russian]
10. Clarke`s analysis of drugs and poisons / Ed.Moffat A.C., Osselton M.D., Widdop B.– London, Pharmaceutical Press, 2011. – Fourth Edition. – Р. 1177