ANTIOXIDANTS OF THE LEAVES OF AMELANCHIER ROTUNDIFOLIA

АНТИОКСИДАНТЫ ЛИСТЬЕВ ИРГИ КРУГЛОЛИСТНОЙ

Научная статья

Тихомирова Т.И.¹, Андреева О.А.², Червонная Н.М.³, Аджиахметова С.Л.^4, *, Лигай Л.В.⁵

³ ORCID: 0000-0001-9685-1384;

⁴ ORCID: 0000-0001-9685-1384;

⁵ORCID: 0000-0001-7754-8793;

^{1, 2, 3, 4, 5} Пятигорский медико-фармацевтический институт – филиал ВолгГМУ, Пятигорск, Россия

* Корреспондирующий автор (similla503[at]mail.ru)

Аннотация

Проведено сравнительное изучение весенних и осенних листьев ирги круглолистной (Amelanchier rotundifolia) на общее количество антиоксидантов, в том числе фенольных соединений и флавоноидов. Содержание антиоксидантов определяли амперометрическим методом на жидкостном хроматографе «Цвет Яуза-01-АА». Общее содержание фенольных соединений устанавливали с использованием реактива Фолина-Чокальтеу, содержание флавоноидов методом дифференциальной спектрофотомерии. Установлено, что оптимальным экстрагентом для извлечения всех антиоксидантов из анализируемого сырья является спирт этиловый 50%. Наибольшее количество антиоксидантов, фенольных соединений и флавоноидов накапливается в весенних листьях. Причём наблюдается чёткая корреляция между общим содержанием антиоксидантов, фенолов и флавоноидов.

Ключевые слова: ирга круглолистная, листья осенние, листья осенние антиоксидантная активность, фенольные соединения, флавоноиды.

ANTIOXIDANTS OF THE LEAVES OF AMELANCHIER ROTUNDIFOLIA

Research article

Tikhomirova T.I.¹, Andreeva O.A.², Chervonnaya N.M.³, Adzhiakhmetova S.L.^4, *, Ligay L.V.⁵

³ ORCID: 0000-0001-9685-1384;

⁴ ORCID: 0000-0001-9685-1384;

⁵ORCID: 0000-0001-7754-8793;

^{1, 2, 3, 4, 5} Pyatigorsk Medical and Pharmaceutical Institute, branch of the Volgograd State Medical University, Pyatigorsk, Russia

* Corresponding author (similla503[at]mail.ru)

Abstract

The article features a comparative study of the spring and autumn leaves of Amelanchier rotundifolia for the total amount of antioxidants, including phenolic compounds and flavonoids. The content of antioxidants was determined by the amperometric method on a liquid chromatograph “Tsvet Yauza-01-AA”. The total content of phenolic compounds was determined using the Folin-Chocalteu reagent, while the content of flavonoids was determined via differential spectrophotometry. It was found that the optimal extractant for extracting all antioxidants from the analyzed raw materials is ethyl alcohol, 50%. The greatest amount of antioxidants, phenolic compounds, and flavonoids accumulates in spring leaves. Moreover, there is a clear correlation between the total content of antioxidants, phenols, and flavonoids.

Keywords: Amelanchier rotundifolia, autumn leaves, autumn leaves antioxidant activity, phenolic compounds, flavonoids.

Введение

Плодовые культуры играют важную роль в жизни людей. Среди них много тех, которые выращиваются в большей степени для декоративных целей и часто называются “второстепенными” культурами, хотя имеют достаточно вкусные съедобные плоды и широко применяются в народной медицине при лечении ряда заболеваний. К таким растениям относится ирга (Amelanchier), которая относится к семейству розоцветные (Rosaceae), трибы яблоневые (Maleae). К настоящему времени известны несколько десятков видов ирги, произрастающих как в дикой природе, так и введённых в культуру [1], [2].

Наше внимание привлекла ирга круглолистная (Amelanchier rotundifolia), которая представляет декоративный листопадный кустарник высотой до 2,5 – 3,0 метров. Родиной её считается Малая Азия, но она широко распространена на Северном Кавказе. В настоящее время, в основном в кулинарии, применяются плоды ирги. Они имеют шарообразную форму и диаметр до 7 – 8 мм, черно-фиолетовый цвет и сладковатый вкус. В народной медицине применяют все части растения, в том числе и листья. Считается, что настой из листьев помогает при гипертонии, бессоннице, сердечно-сосудистых заболеваниях, а чай обладает обволакивающим и вяжущим свойствам [3].

Объяснить такое лечебное свойство листьев можно в первую очередь содержанием в них антиоксидантов и, прежде всего, фенольных соединений.

Целью работы явилось изучение листьев ирги круглолистных на наличие в них фенольных соединений и определение их количественного содержания.

Материалы и методы

Сырьём для исследования явились листья ирги круглолистной собранные весной (в мае) и осенью (в октябре) 2020 года в ботаническом саду Пятигорского медико-фармацевтического института. Листья высушивали теневой сушкой до постоянной массы

Определение наличия в сырье фенольных соединений проводили с помощью качественных реакций в пробирках и методом бумажной хроматографии на бумаге марки FN 7.

Определение суммарного содержания антиоксидантов исследовали на жидкостном хроматографе «Цвет Яуза-01-АА» амперометрическим методом.

Используя градуировочный график зависимости выходного сигнала от концентрации кверцетина и галловой кислоты, измеряли массовую концентрацию антиоксидантов [4], [5, С. 10–14], [6, С.130–135].

Массовую концентрацию (мг/г) определяли по формуле 1:

    (1)

где: Х_г – массовая концентрация антиоксидантов, найденная по градуировочному графику, мг/л; V_n – объем анализируемого извлечения, мл; m_n – навеска анализируемого сырья, г; N – кратность разбавления анализируемого извлечения.

Общее содержание фенольных соединений устанавливали спектрофотометрически по продуктам их окисления с реактивом Фолина-Чокальтеу [7, С. 373-380], [8, С. 242-251].

Концентрацию фенольных соединений в пересчете на галловую кислоту в анализируемом растворе определяли по градуировочному графику, а содержание в процентах (X) в пересчете на абсолютно сухое сырье рассчитывали по формуле 2:

     (2)

где: C – концентрация фенольных соединений в исследуемом извлечении, найденная по градуировочному графику, г/100мл; a – навеска сырья, г; V_a – объем аликвоты, мл; W₁, W₂ – объемы мерных колб, мл; W – потеря в массе при высушивании, % [9, С. 152-178], [10, С. 15-22], [11, С. 225-232].

Сумму флавоноидов так же определяли спектрофотометрическим методом с использованием прибора спектрофотометр СФ-102. Расчёт их содержания проводили в пересчете на кверцетин и абсолютно сухое сырье в процентах (Х₁) по формуле 3:

    (3)

где: А – оптическая плотность исследуемого раствора;  – удельный показатель поглощения комплекса рутина с алюминия хлоридом при длине волны 408-415нм, равный 248; a – навеска сырья, г; W – влажность сырья, % [12].

Результаты и обсуждения

Качественные реакции, позволяющие установить в сырье наличие фенольных соединений, проводили как с осенними, так и с весенними листьями. Использовали порции сырья по 5 грамм. Часть порций экстрагировали водой дистиллированной, а часть 96%-ным этанолом в колбе с обратным холодильником на водяной бане в течение 45 минут. Извлечения сгущали до 1/3 объёма. С водными извлечениями проводили качественные пробирочные реакции. При добавлении нескольких капель 2%-ного водного раствора FeCI₃ наблюдали зелёную окраску. При добавлении 5%-ного водного раствора NaOH наблюдали ярко-жёлтую окраску. Оба результата могут быть следствием наличия в сыре фенольных соединений.

Спиртовые извлечения использовали для хроматографических исследований. В качестве элюирующих систем применяли системы: н– бутанол – кислота уксусная – вода (БУВ) с соотношении 4 : 1: 2 и кислота уксусная 15%. Хроматограммы просматривали в видимом и ультрафиолетовом свете, до и после обработки хромогенными реагентами. Использовали пары аммиака, 5%-ный водный раствор гидроксида натрия, 5%-ный спиртовый раствор хлорида алюминия, водный раствор хлорида железа (III). Как в извлечениях, полученных из осенних листьев, так и в извлечениях из весенних листьев, после обработки хроматограмм водным раствором хлорида железа (III), наблюдали по пять пятен, окрашенных в зелёный цвет. В УФ-свете эти пятна имели голубую, фиолетовую и темно-коричневую флюоресценцию. После обработки вышеописанными реактивами окраска пятен менялась: от паров NH₃ пятна становились ярко голубыми и жёлто-зелёными; от растворов NaOH и AICI₃ в видимом свете – приобретали желтовато-зеленую окраску, а в УФ-свете жёлто-зелёную флюоресценцию. Такое поведение веществ на хроматограммах может подтверждать их фенольную природу.

Для определения суммарного содержания антиоксидантов, суммы фенольных соединений методом Фолина-Чокальтеу, суммы антиоксидантов и суммы флавоноидов в извлечениях пробы сырья по 1 грамму трижды экстрагировали на водяной бане в колбе с обратным холодильником спиртом этиловым: 90%-ным, 70%-ным, 50%-ным и водой дистиллированной (очищенной). Объединённые водно-спиртовые и водные извлечения объединяли, фильтровали в колбы по 100 мл, отбирали пробы по 1мл и использовали для анализа.

Суммарное содержание антиоксидантов в исследуемых извлечениях

Содержание антиоксидантов в спиртовых, водно-спиртовых и водных извлечениях из листьев ирги в пересчете на кверцетин и галловую кислоту, площади пиков и кратность разбавления представлены в таблице 1.

Таблица 1 – Содержание антиоксидантов (в пересчете на кверцетин и галловую кислоту)
в извлечениях из ирги круглолистной

Амперометрическим методом установлено, что оптимальным экстрагентом суммы антиоксидантом из исследуемого сырья является спирт этиловый 50%, причём весенние листья по их содержанию значительно превосходят осенние листья.

Определение суммарного содержания фенольных соединений методом Фолина-Чокальтеу

Определение линейности методики и построение градуировочного графика [10, С. 15-22], [13] представлены в таблице 2 и на рисунке 1, содержание суммы фенольных соединений в извлечениях в таблице 3.

Таблица 2 – Оптическая плотность анализируемых растворов галловой кислоты с реактивом Фолина-Чокальтеу

Визуальная оценка графика свидетельствует о его линейности, кроме того коэффициент корреляции составил 0,997, что позволяет использовать данный график для количественного определения фенольных соединений.

Рис. 1 – Градуировочный график взаимодействия кислоты галловой с реактивом Фолина-Чокальтеу

Уравнение градиуровочного графика имеет вид: y = 1746x+0,004.

Рис. 2 – УФ-спектр поглощения комплекса извлечений полученных экстракцией 90% спиртом этиловым (1), водой очищенной (2), 70% (3) и 50% (4) спиртом этиловым из листьев ирги, собранных весной, с реактивом Фолина-Чокальтеу

Таблица 3 – Содержание суммы фенольных соединений в извлечениях из листьев ирги, полученных экстракцией спиртом этиловым различной концентрации и водой очищенной

Из данных таблицы следует, что максимальное содержание суммы фенольных соединений наблюдается в извлечении из листьев ирги, собранных весной, полученном экстракцией 50% спиртом этиловым, и составляет 7,568±0,015%.

Количественное определение флавоноидов

Установлено, что комплексное соединение рутина и извлечений из листьев ирги, полученного экстракцией 50% и 70% спиртом этиловым, с 2% спиртовым раствором алюминия хлорида, имеют максимальное поглощение при одной и той же длине волны 410±2 нм (рис. 3). Содержание суммы флавоноидов в извлечениях, полученных из листьев ирги представлено в таблице 4.

Рис. 3 – УФ-спектр поглощения комплекса 50% спиртового извлечения из листьев ирги круглолистной, собранных весной (А) и собранных осенью (Б), с 2% спиртовым раствором алюминия хлорида

Количественное определение флавоноидов проводили в 6 повторностях.

Таблица 4 – Содержание суммы флавоноидов в извлечениях, полученных из листьев ирги

Анализ полученных результатов позволил установить, что спирт этиловый 50% является лучшим экстрагентом для извлечения суммы флавоноидов, чем наиболее часто используемый для получения этих веществ, спирт этиловый 70%. Наибольшее количество флавоноидов накапливается в листьях ирги весной и составляет 2,980±0,008%.

Заключение

В результате проведённых исследований установлено, что листья ирги круглолистной произрастающей в районе города Пятигорска содержат значительное количество антиоксидантов, в том числе фенольных соединений и флавоноидов. Выявлено соответствие между общим содержанием антиоксидантов, фенолов и флавоноидов наибольшее количество которых накапливается в листьях собранных весной. Оптимальным экстрагентом для выделения антиоксидантов является спирт этиловый 50%.