Pages Navigation Menu
Submit scientific paper, scientific publications, International Research Journal | Meždunarodnyj naučno-issledovatel’skij žurnal

ISSN 2227-6017 (ONLINE), ISSN 2303-9868 (PRINT), DOI: 10.18454/IRJ.2227-6017
ЭЛ № ФС 77 - 80772, 16+

DOI: https://doi.org/10.23670/IRJ.2021.108.6.037

Download PDF ( ) Pages: 26-30 Issue: № 6 (108) Part 2 () Search in Google Scholar
Cite

Cite


Copy the reference manually or choose one of the links to import the data to Bibliography manager
Balloul Ghadeer et al. "A COMPARISON OF THE BACTERICIDAL ACTIVITY OF OFLOXACIN SEPARATELY AND IN COMBINATION WITH BENZYL ALCOHOL AGAINST PATHOGENIC MICROORGANISMS AND FUNGI THAT CAUSE OTITIS MEDIA". Meždunarodnyj naučno-issledovatel’skij žurnal (International Research Journal) № 6 (108) Part 2, (2021): 26. Mon. 05. Jul. 2021.
Balloul, Ghadeeret al., (2021). SRAVNENIE BAKTERICIDNOY DEYATELYNOSTI OFLOKSACINA OTDELYNO I V KOMBINACII S BENZILOVYM SPIRTOM V OTNOSHENII PATOGENNYH MIKROORGANIZMOV I GRIBOV, VYZYVAYUSCHIH OTIT SREDNEGO UHA [A COMPARISON OF THE BACTERICIDAL ACTIVITY OF OFLOXACIN SEPARATELY AND IN COMBINATION WITH BENZYL ALCOHOL AGAINST PATHOGENIC MICROORGANISMS AND FUNGI THAT CAUSE OTITIS MEDIA]. Meždunarodnyj naučno-issledovatel’skij žurnal, № 6 (108) Part 2, 26-30. http://dx.doi.org/10.23670/IRJ.2021.108.6.037
Balloul Ghadeer. A COMPARISON OF THE BACTERICIDAL ACTIVITY OF OFLOXACIN SEPARATELY AND IN COMBINATION WITH BENZYL ALCOHOL AGAINST PATHOGENIC MICROORGANISMS AND FUNGI THAT CAUSE OTITIS MEDIA / Ghadeer. Balloul, E. T. Zhilyakova, N. N. Boyko и др. // Mezhdunarodnyj nauchno-issledovatel'skij zhurnal. — 2021. — № 6 (108) Part 2. — С. 26—30. doi: 10.23670/IRJ.2021.108.6.037

Import


A COMPARISON OF THE BACTERICIDAL ACTIVITY OF OFLOXACIN SEPARATELY AND IN COMBINATION WITH BENZYL ALCOHOL AGAINST PATHOGENIC MICROORGANISMS AND FUNGI THAT CAUSE OTITIS MEDIA

СРАВНЕНИЕ БАКТЕРИЦИДНОЙ ДЕЯТЕЛЬНОСТИ ОФЛОКСАЦИНА ОТДЕЛЬНО И В КОМБИНАЦИИ
С БЕНЗИЛОВЫМ СПИРТОМ В ОТНОШЕНИИ ПАТОГЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ И ГРИБОВ, ВЫЗЫВАЮЩИХ ОТИТ СРЕДНЕГО УХА

Научная статья

Баллул Гадир1, *, Жилякова Е.Т.2, Бойко Н.Н.3, Аль-рубайе Висам Махмуд4, Иванова В.Э.5,
Малютина А.Ю.6, Радюкова В.И.7, Молдаванова А.Ю.8

1 ORCID: 0000-0001-5097-7790;

3 ORCID: 0000-0001-9222-2935;

1-8 Белгородский Государственный Национальный Исследовательский Университет, Белгород, Россия;

3 Университет Дружбы Народов, Москва, Россия

* Корреспондирующий автор (ghadeerballoul[at]gmail.com )

Аннотация

Проблема со средним отитом всегда актуальна для отоларингологов. Известно, что воспалительный процесс может образовываться в полостях среднего уха, что является основной причиной воспалительного процесса в среднем ухе. Самая большая проблема — это распространенность в раннем детстве, острый средний отит излечивается, если вовремя применить соответствующее лечение. В случае неиспользования подходящего дентина существует риск стойкой потери слуха и глухоты. Бактерии – самые важные микроорганизмы, вызывающие средний отит, особенно Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae и Moraxella catarrhali. Поэтому для бактерицидного действия на патогенные микроорганизмы были выбраны антибиотики, которые являются эффективными и безопасными, среди них были фторхинолоны и местные антисептики, такие как бензиловый спирт, и результаты были очень хорошими, так как эксперименты показали, что при смешивании офлоксацин с бензиловым спиртом в спиртовой среде 70%, бактерицидная способность микроорганизмов, которые вызывают отит среднего уха будет увеличиваться. Проведено шестикратное повторение эксперимента на большинстве видов микроорганизмов, которые могут быть причиной отита как Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Proteus vulgaris, Basillus subtilis, Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae и Moraxella catarrhalis. Диаметр задержки роста бактерий с помощью антимикробных препаратов был рассчитан на агаровом слое. Дополнительная бактериостатическая реакция была получена в смеси офлоксацина и бензилового спирта.

Ключевые слова: отит, офлоксацин, бензиловый спирт, фторхинолоны, Streptococcus pneumonia, Haemophilus influenza, Moraxella catarrhalis, метод диффузии в агар «колодцами».

A COMPARISON OF THE BACTERICIDAL ACTIVITY OF OFLOXACIN SEPARATELY AND IN COMBINATION WITH BENZYL ALCOHOL AGAINST PATHOGENIC MICROORGANISMS AND FUNGI THAT CAUSE OTITIS MEDIA

Research article

Balloul Ghadeer1, *, Zhilyakova E.T.2, Boyko N.N.3, Al-rubaye Wisam Mahmud4, Ivanova V.E.5,
Malyutina A.Yu.6, Radyukova V.I.7, Moldavanova A.Yu.8

1 ORCID: 0000-0001-5097-7790;

3 ORCID: 0000-0001-9222-2935;

1-8 Belgorod State National Research University Research University, Belgorod, Russia;

3 Peoples ‘ Friendship University of Russia, Moscow, Russia

* Corresponding author (ghadeerballoul[at]gmail.com)

Abstract

The problem with otitis media is always relevant for otolaryngologists. It is a known fact that the inflammatory process can form in the cavities of the middle ear. The biggest problem is the prevalence in early childhood. Acute otitis media is cured if the appropriate treatment is applied in time. If the appropriate dentin is not used, there is a risk of permanent hearing loss. Bacteria are the most important microorganisms that cause otitis media, especially Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, and Moraxella catarrhali. Therefore, for the bactericidal action on pathogenic microorganisms, antibiotics that are effective and safe were chosen, among them were fluoroquinolones and local antiseptics such as benzyl alcohol, which demonstrated thoroughly satisfying results, since experiments showed that when mixing ofloxacin with benzyl alcohol in an alcohol medium of 70%, the bactericidal ability of microorganisms that cause otitis media of the middle ear will increase. A six-fold repetition of the experiment was performed on most types of microorganisms that can cause otitis media, such as Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Proteus vulgaris, Basillus subtilis, Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae and Moraxella catarrhalis. The study also calculated the diameter of bacterial growth retardation with antimicrobial agents on the agar layer. An additional bacteriostatic reaction was obtained in a mixture of ofloxacin and benzyl alcohol.

Keywords: otitis media, ofloxacin, benzyl alcohol, fluoroquinolones, Streptococcus pneumonia, Haemophilus influenza, Moraxella catarrhalis, agar diffusion.

Введение

Средний отит — это инфекция среднего уха, которая вызывает боль из-за давления на барабанную перепонку, и подразделяется на острый средний отит (ОСО), хронический гнойный средний отит (ХГСО) и средний отит с выпотом (СОВ). Острый средний отит очень часто встречается в детстве, особенно в возрасте от 6 до 24 месяцев [1]. Многие микроорганизмы проникают в ухо и вызывают инфекции, но наиболее распространенными микроорганизмами, вызывающими средний отит, являются Streptococcus pneumoniae, за которыми следуют нетипируемые Haemophilus influenzae (NTHi) и Moraxella catarrhalis [2].

Moraxella catarrhalis – специфический для человека комменсал дыхательных путей и условно-патогенный микроорганизм [3], это третья по частоте причина острого синусита и среднего отита у детей и отвечает за различные инфекции нижних дыхательных путей у иммунокомпетентных хозяев и пациентов с хроническими заболеваниями легких [4]. Streptococcus. pneumonia это факультативный анаэробный грамположительный организм, который обычно встречается парами или короткими цепочками. Пневмония, вызванная S. bacterium, является патогенным заболеванием человека [5], на него приходится 30–50% всех случаев среднего отита, что составляет примерно 300 миллионов случаев инфекции среднего уха во всем мире ежегодно [6]. Haemophilus influenzae (ранее называвшаяся Pfeiffers bacillus или Bacillus influenzae) – грамотрицательная коккобациллярная факультативно анаэробная капнофильная патогенная бактерия семейства Pasteurellaceae [7], это распространенный комменсал верхних дыхательных путей и патоген только для человека, который может вызывать тяжелые инвазивные заболевания, включая менингит, пневмонию и сепсис [8]. Staphylococcus aureus комменсальная бактерия. Примерно 30% людей инфицированы золотистым стафилококком. В то же время он является основной причиной бактериемии и эндокардита (БЭ), а также суставных костей, кожи, мягких тканей, легочной плевры и инфекций, связанных с органами [9]. Pseudomonas aeruginosa является грамотрицательным, вызывает средний отит / внешние инфекции. Эта бактерия по своей природе устойчива к широкому спектру противомикробных препаратов, включая бензилпенициллины, аминобензилпенициллины, карбоксипенициллины, цефалоспорины 1-го и 2-го поколения, хлорамфеникол и тетрациклины [10].

Лечение основано на местных и системных анальгетиках, местных и системных антибиотиках, особенно на фторхинолонах, которые представляют собой широкий спектр бактерицидов широкого спектра действия с широкой активностью против грамположительных и грамотрицательных бактерий [11]. Фторхинолоны (ФТХЫ) представляют собой группу синтетических антибиотиков широкого спектра действия. ФТХЫ подходят для лечения многих сложных заболеваний, таких как инфекции мочевыводящих путей, желудочно-кишечные инфекции, респираторные инфекции, заболевания, передаваемые половым путем, и кожные инфекции [12], [13], они эффективны в отношении множества патогенов, включа P. aeruginosa and Mycoplasma spp и Chlamydia spp. и Staphylococcus spp and Streptococcus spp [14].

Целью нашей работы было сравнить действие офлоксацина, используемого в качестве ушной капли, с эффектом комбинации офлоксацина и бензилового спирта в 70% спирте.

Задачи исследования: установить уровень активность комбинации офлоксацина и бензилового спирта в 70% спирте против микроорганизмов, вызывающих средний отит.

Материалы и методы

Метод диффузии в агар «колодцами». Этот метод основан на инокуляции поверхности чашки с агаром путем распределения объема микробного инокулята по всей поверхности агара. Затем отверстие диаметром от 6 до 8 мм протыкается в асептических условиях с помощью сверла или стерильного пробкового наконечника, и в лунку вводится объем (20-100 мкл) антимикробного средства или экстракционного раствора необходимой концентрации. Затем чашки с агаром инкубируют в подходящих условиях в зависимости от микроорганизма для теста. Антимикробный агент диффундирует в агаровую среду и предотвращает рост тестируемого штамма микробов [15].

Материалы

Антибактериальные агенты

  • Офлоксацин (Muzi Agricultural Ltd, China) и Бензиловый спирт (Supelco; Emprove® Chemicals Portfolio, Germany) были смешаны в одной фармацевтической форме с этанолом 70%.
  • Офлоксацин отдельно, так как ушные / глазные капли были куплены в местной аптеке.

Офлоксацин был разработан в виде 0,3% отического раствора для лечения ушных инфекций. При местном применении 0,3% отического раствора офлоксацина концентрация препарата в ухе очень высока, что значительно расширяет спектр действия офлоксацина, для защиты от наиболее распространенных патогенов уха [16] и пестицидов для микроорганизмов, таких как бензиловый спирт, который используется для лечения среднего отита, он принадлежит к бензильной группе, который в основном используется как консервант, антибактериальный и противогрибковый агент широкого спектра действия, особенно Aspergillus niger, Candida albicans, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa и Staphylococcus aureus [17].

Бактериальные штаммы

Мы использовали эти типы микроорганизмов, их штаммы представлены в таблице 1.

 

Таблица 1 – Типы микроорганизмов с бактериальными штаммами, которые использовались в исследовании

Микроорганизм Штаммы
Staphylococcus aureus АТСС 25923
Escherichia coli АТСС 25922
Proteus vulgaris ATCC 4636
Pseudomonas aeruginosa АТСС 27853
Basillus subtilis АТСС 6633
Candida albicans ATCC 653/885
Moraxella catarrhalis ATCC 25238
Streptococcus pneumonia ATCC 6303
Haemophilus influenza ATCC 51907

 

Основные результаты

Метод диффузии в агар «колодцами» показаны зоны ингибирования (ЗИ) антибиотиков против микроорганизмов, которые были упомянуты выше в таблице 1, а в таблице 2 показан каждый антибиотик с его соответствующим ЗИ, измеренным в миллиметрах (мм). Данные были получены из шести независимых экспериментов.

В этом исследовании мы показали, что активность одного офлоксацина меньше, чем его активность в сочетании с бензиловым спиртом. Это указывает на правильное участие и четкую поддержку путем увеличения диаметра ингибирования бактериального на слой агара.

 

Таблица 2 – Диаметры зон задержки роста

Антибиотики / Микроорганизмы Смесь офлоксацина 0,3% и бензилового спирта 1% с этанолом 70% число повторов опыта n=6 среднее значение диаметра ± его ошибка, мм Офлоксацин отдельно 0.3% без бензилового спирта число повторов опыта n=6 среднее значение диаметра ± его ошибка, мм
Staphylococcus aureus 45.00±0.00 34.66±1.45
Escherichia coli 35.00±0.00 28.66±1.45
Proteus vulgaris 33.66±1.45 25.00±0.00
Pseudomonas aeruginosa 34.00±0.00 25.33±1.45
Basillus subtilis 43.00±0.00 37.66±1.45
Candida albicans 32.66±1.45 19.66±1.45
Moraxella catarrhalis 44.66±1.45 34.66±1.45
Streptococcus pneumonia 35.00±0.00 28.66±1.45
Haemophilus influenza 44.33±1.45 34.66±1.45

 

Обсуждение результатов

В этом исследовании была оценена чувствительность нескольких типов бактерий и грибов к выбранному антибиотику путем выявления областей ингибирования с использованием метода диффузии в лунках агара. Данные, полученные в результате настоящего исследования, показали, что выбранный офлоксацин показал значительные области ингибирования роста, хотя чувствительность выбранных микроорганизмов к этому антибиотику варьируется от высокой до средней. При использовании одного офлоксацина диаметр бактериального ингибирования (от 20 до 35 мм) был меньше диаметра ингибирования при использовании комбинации офлоксацина и бензилового спирта в концентрации 0,3% и 1% соответственно (от 33 до 45 мм). и это подтверждает наличие поддержки между двумя антибиотиками.

Заключение

Использование комбинации офлоксацина и бензилового спирта в 70% спирте – один из важных вариантов лечения среднего отита, как показано результаты экспериментов, наблюдается явное повышение эффективности антибактериальных средств, особенно в отношении микроорганизмов, вызывающих средний отит.

Благодарности

Первый автор благодарит «Supelco; Компания Emprove® Chemicals Portfolio в Германии», чтобы бесплатно отправить ему порошок бензилового спирта для завершения его исследования. 

Acknowledgement

The first author thanks “Supelco; Emprove® Chemicals Portfolio company in Germany” to send him the benzyl alcohol powder for free to complete his research.

Конфликт интересов

Не указан.

Conflict of Interest

None declared.

Список литературы / References

  1. Meherali S. Understanding parent experiences and information needs in pediatric acute otitis media: a qualitative study / S. Meherali, A. Campbell, L. Hartling et al. // J Patient Exp. 2019 March; 6 (1): 53-61
  2. Ubukata K. AOM Surveillance Research Group. Etiology of acute otitis media and characteristics of pneumococcal isolates after administration of 13-valent pneumococcal conjugate vaccine in Japanese children / K. Ubukata, M. Morozumi, M. Sakuma et al. // Pediatrician. Infect. Dis. J. 2018 Jun; 37 (6): 598-604.
  3. Laabei M. Antibacterial hybrid proteins improve the killing of Moraxella catarrhalis / Laabei Maisem, Colino Lucy, Bettoni Serena et al. // Frontiers in Immunology, VOLUME = 11, 2020/2122.
  4. Su Y. S. Moraxella catarrhalis: from interaction with the host immune system to vaccine development / Y. S. Su, B. Singh, K. Risbek // Future Microbiol. (2012) 7: 1073–100. DOI: 10.2217 / fmb.12.80.
  5. Dion C. F. Pneumococcus. [Updated August 10, 2020] / C. F. Dion, Sp. Ashurst //In: StatPearls [Internet]. Treasure Island (Florida): StatPearls Publishing; 2020 Jan.
  6. Bergenfelz C. Streptococcus pneumoniae The pathogenesis of otitis media and how it affects our understanding of vaccination strategies / C. Bergenfelz, A.P. Hakansson // Curr Otorhinolaryngol Rep. 2017; 5 (2): 115–124. DOI: 10.1007 / s40136-017-0152-6
  7. Kuhnert, P. Pasteurellaceae: biology, genomics, and molecular aspects / Kuhnert, P; Christensen, H, eds.. Caister Academic Press. 2008. ISBN 978-1-904455-34-9
  8. Kasper D. L. Infectious diseases of Harrison / D. L. Kasper, A. S. Fauci. 2nd ed. Columbus (Ohio): McGraw-Hill Education; 2013.
  9. Tong S. Y. Infections caused by Staphylococcus aureus: epidemiology, pathophysiology, clinical manifestations and treatment / S. Y. Tong, J. S. Davis, E. Eichenberger et al. // Clin Microbiol Rev.2015; 28 (3): 603-661. DOI: 10.1128 / CMR.00134-14.
  10. Penna B. Antimicrobial resistance of Pseudomonas aeruginosa isolated from canine otitis externa in Rio de Janeiro, Brazil, in vitro / B. Penna, S. Thome, R. Martins et al. // Braz. J. Microbiol. [Internet]. 2011 December [cited October 16, 2020]; 42 (4): 1434-1436.
  11. Scavone C. Fluoroquinolones-induced musculoskeletal, Neurological and psychiatric ADR: a pharmacovigilance study based on data from the Italian Spontaneous Reporting System / Scavone Cristina, Mascolo Annamaria, Ruggero Rosanna, Sportiello Liberata et al. // Frontiers in Pharmacology, 11, 2020: P428.
  12. Oliphant K. M., Green G. M. Quinolones: a comprehensive review / K. M. Oliphant, G. M. Green // Am. Fam. Phys. 2002; 65: 455–464.
  13. Sonya K. Fluoroquinolones: chemistry and action – review. Indo Glob / K. Sonya // J. Pharm. Sci. 2012; 2: 43–53.
  14. Somasundaram S. An Overview of Fluoroquinolones / S. Somasundaram, K. Manivannan // Ann. Rev. Res. Biol. 2013; 3: 296-313.
  15. ОФС.1.2.4.0010.15. Определение антимикробной активности антибиотиков методом диффузии в агар. Взамен ст. ГФ XII, ч.1, ОФС 42–0068–07.
  16. Simpson K. L. Ofloxacin otic solution: a review of its use in the management of ear infections / K. L. Simpson, A. Markham // Drugs. 1999 September; 58 (3): 509-531. DOI: 10.2165 / 00003495-199958030-00019.
  17. Rowe R. S. Handbook of Pharmaceutical Excipients / Raymond S. Rowe; Paul J. Shesky; Marian E Quinn. -6th Edition, 2009; 64-66.

Список литературы на английском языке / References in English

  1. Meherali S. Understanding parent experiences and information needs in pediatric acute otitis media: a qualitative study / S. Meherali, A. Campbell, L. Hartling et al. // J Patient Exp. 2019 March; 6 (1): 53-61
  2. Ubukata K. AOM Surveillance Research Group. Etiology of acute otitis media and characteristics of pneumococcal isolates after administration of 13-valent pneumococcal conjugate vaccine in Japanese children / K. Ubukata, M. Morozumi, M. Sakuma et al. // Pediatrician. Infect. Dis. J. 2018 Jun; 37 (6): 598-604.
  3. Laabei M. Antibacterial hybrid proteins improve the killing of Moraxella catarrhalis / Laabei Maisem, Colino Lucy, Bettoni Serena et al. // Frontiers in Immunology, VOLUME = 11, 2020/2122.
  4. Su Y. S. Moraxella catarrhalis: from interaction with the host immune system to vaccine development / Y. S. Su, B. Singh, K. Risbek // Future Microbiol. (2012) 7: 1073–100. DOI: 10.2217 / fmb.12.80.
  5. Dion C. F. Pneumococcus. [Updated August 10, 2020] / C. F. Dion, Sp. Ashurst //In: StatPearls [Internet]. Treasure Island (Florida): StatPearls Publishing; 2020 Jan.
  6. Bergenfelz C. Streptococcus pneumoniae The pathogenesis of otitis media and how it affects our understanding of vaccination strategies / C. Bergenfelz, A.P. Hakansson // Curr Otorhinolaryngol Rep. 2017; 5 (2): 115–124. DOI: 10.1007 / s40136-017-0152-6
  7. Kuhnert, P. Pasteurellaceae: biology, genomics, and molecular aspects / Kuhnert, P; Christensen, H, eds.. Caister Academic Press. 2008. ISBN 978-1-904455-34-9
  8. Kasper D. L. Infectious diseases of Harrison / D. L. Kasper, A. S. Fauci. 2nd ed. Columbus (Ohio): McGraw-Hill Education; 2013.
  9. Tong S. Y. Infections caused by Staphylococcus aureus: epidemiology, pathophysiology, clinical manifestations and treatment / S. Y. Tong, J. S. Davis, E. Eichenberger et al. // Clin Microbiol Rev.2015; 28 (3): 603-661. DOI: 10.1128 / CMR.00134-14.
  10. Penna B. Antimicrobial resistance of Pseudomonas aeruginosa isolated from canine otitis externa in Rio de Janeiro, Brazil, in vitro / B. Penna, S. Thome, R. Martins et al. // Braz. J. Microbiol. [Internet]. 2011 December [cited October 16, 2020]; 42 (4): 1434-1436.
  11. Scavone C. Fluoroquinolones-induced musculoskeletal, Neurological and psychiatric ADR: a pharmacovigilance study based on data from the Italian Spontaneous Reporting System / Scavone Cristina, Mascolo Annamaria, Ruggero Rosanna, Sportiello Liberata et al. // Frontiers in Pharmacology, 11, 2020: P428.
  12. Oliphant K. M., Green G. M. Quinolones: a comprehensive review / K. M. Oliphant, G. M. Green // Am. Fam. Phys. 2002; 65: 455–464.
  13. Sonya K. Fluoroquinolones: chemistry and action – review. Indo Glob / K. Sonya // J. Pharm. Sci. 2012; 2: 43–53.
  14. Somasundaram S. An Overview of Fluoroquinolones / S. Somasundaram, K. Manivannan // Ann. Rev. Res. Biol. 2013; 3: 296-313.
  15. General Pharmacopoeia Monograph.1.2.4.0010.15. Opredelenie antimikrobnojj aktivnosti antibiotikov metodom diffuzii v agar [Determination of Antimicrobial Activity of Antibiotics by Diffusion Into Agar]. State Pharmacopoeia of the Russian Federation XII edition, part 1, General Pharmacopoeia Monograph 42-0068-07 [in Russian]
  16. Simpson K. L. Ofloxacin otic solution: a review of its use in the management of ear infections / K. L. Simpson, A. Markham // Drugs. 1999 September; 58 (3): 509-531. DOI: 10.2165 / 00003495-199958030-00019.
  17. Rowe R. S. Handbook of Pharmaceutical Excipients / Raymond S. Rowe; Paul J. Shesky; Marian E Quinn. -6th Edition, 2009; 64-66.

Leave a Comment

Your email address will not be published. Required fields are marked *

Лимит времени истёк. Пожалуйста, перезагрузите CAPTCHA.