Pages Navigation Menu
Submit scientific paper, scientific publications, International Research Journal | Meždunarodnyj naučno-issledovatel’skij žurnal

ISSN 2227-6017 (ONLINE), ISSN 2303-9868 (PRINT), DOI: 10.18454/IRJ.2227-6017
ПИ № ФС 77 - 51217, 16+

DOI: https://doi.org/10.23670/IRJ.2017.58.132

Download PDF ( ) Pages: 27-30 Issue: № 04 (58) Part 1 () Search in Google Scholar
Cite

Cite


Copy the reference manually or choose one of the links to import the data to Bibliography manager
Kuklina N.G. et al. "DEVELOPMENT OF THE SEPARATION AND IDENTIFICATION DIAGRAM OFAEROMONAS SALMONICIDA BACTERIA". Meždunarodnyj naučno-issledovatel’skij žurnal (International Research Journal) № 04 (58) Part 1, (2017): 27. Mon. 17. Apr. 2017.
Kuklina, N.G., & Vasiliev, D.A., & Nafeev, A.A., & (2017). RAZRABOTKA BAKTERIOLOGICHESKOY SHEMY VYDELENIYA I IDENTIFIKACII BAKTERII AEROMONAS SALMONICIDA [DEVELOPMENT OF THE SEPARATION AND IDENTIFICATION DIAGRAM OFAEROMONAS SALMONICIDA BACTERIA]. Meždunarodnyj naučno-issledovatel’skij žurnal, № 04 (58) Part 1, 27-30. http://dx.doi.org/10.23670/IRJ.2017.58.132
Kuklina N. G. DEVELOPMENT OF THE SEPARATION AND IDENTIFICATION DIAGRAM OFAEROMONAS SALMONICIDA BACTERIA / N. G. Kuklina, D. A. Vasiliev, A. A. Nafeev // Mezhdunarodnyj nauchno-issledovatel'skij zhurnal. — 2017. — № 04 (58) Part 1. — С. 27—30. doi: 10.23670/IRJ.2017.58.132

Import


DEVELOPMENT OF THE SEPARATION AND IDENTIFICATION DIAGRAM OFAEROMONAS SALMONICIDA BACTERIA

Куклина Н.Г.1, Васильев Д.А.2, Нафеев А.А.3

1научный сотрудник,

2Доктор биологических наук, профессор,

3Доктор медицинских наук

ФГБОУ ВО «Ульяновская ГСХА им. П.А. Столыпина»

РАЗРАБОТКА БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКОЙ СХЕМЫ ВЫДЕЛЕНИЯ И ИДЕНТИФИКАЦИИ БАКТЕРИИ AEROMONAS SALMONICIDA

Аннотация

Представлена бактериологическая схема выделения и идентификации бактерии A. salmonicida с использованием оригинальных питательных сред и комплекса бактериологических тестов. Разработанные питательные среды специфичны по отношению к бактериям-ассоциантам других видов и родов. Предлагаемая схема предполагает выделение и идентификацию микроорганизма за 60-84 часа. В результате апробирования данной схемы было выделено 17 штаммов A. salmonicida из 97 проб, отобранных из водных объектов г. Ульяновска и Ульяновской области.

Ключевые слова: аэромоноз, бактериологическая схема выделения, питательные среды, A. salmonicida.

Kuklina N.G.1, Vasiliev D.A.2, Nafeev A.A.3

1Research scientist,

2PhD in Biology, Professor,

3MD,

Ulyanovsk State Agricultural Academy named after P.A. Stolypin

DEVELOPMENT OF THE SEPARATION AND IDENTIFICATION DIAGRAM OFAEROMONAS SALMONICIDA BACTERIA

Abstract

A diagram for separation and identification of bacterium A. Salmonicida using original nutrient media and a complex of bacteriological tests is presented in the paper. The developed nutrient media are specific with regard to bacteria-associates of other species and genus. The proposed scheme assumes separation and identification of the microorganism in 60-84 hours. As a result of the testing of this scheme, 17 strains of A. Salmonicida were detected in 97 samples taken from water bodies in Ulyanovsk and the Ulyanovsk region.

Keywords: aeromonose, bacteriological separation diagram, nutrient media, A. Salmonicida.

Бактерия A. salmonicida является возбудителем фурункулеза (аэромоноза) рыб не только представителей семейства лососевых, но и других семейств. Фурункулез-это высококонтагиозная болезнь, протекающая остро, подостро и хронически. Зараженные рыбы с открытыми ранами являются источниками распространения A. salmonicida. В связи с высокой плотностью выращивания рыбы в хозяйствах, эта болезнь быстро распространяется с высоким процентом летальности [1, С. 136].

Согласно Инструкции о мероприятиях по профилактике и мерам борьбы с фурункулезом лососевых рыб от 26.11.1997 №13-4-4/1090 Диагноз на фурункулез устанавливают на основании эпизоотических данных, клинических признаков, патологоанатомических изменений, результатов бактериологического исследования и положительной биопробы, которое занимает до 10 дней [2].

Нами была разработана бактериологическая схема выделения и идентификации данного вида микроорганизма, включающая специальные среды – жидкую накопительную среду A.Sl.1-УГСХА, плотную селективную среду A.Sl.2-УГСХА и ряд бактериологических тестов, которая позволяет сократить время на исследование до 84 ч.

При конструировании питательных сред подбор питательных веществ осуществлялся экспериментальным путем. В результате исследований жидкая среда A.Sl.1-УГСХА имеет следующий состав: вода дистиллированная – 1000 мл, K2HPO4 – 1г, MgSO4 – 0,2 г, NaCl- 5г, пептон -5 г, бромтимоловый синий – 0,03 г, глюкоза – 5 г, BaCl2 – 2 г. pH готовой среды накопления = 7,1. Способ приготовления – в дистиллированную воду добавляют пептон, минеральные соли, глюкозу, бромтимоловый синий. Среду доводят до полного растворения частиц, разливают в стерильные пробирки по 5 мл и автоклавируют при 0,5 атм в течение 20 минут. Готовая среда прозрачная, травянисто-зеленого цвета.

Нами была разработана плотная дифференциально-диагностическая среда A.Sl.2-УГСХА следующего состава – вода дистиллированная – 1000 мл, агар – 15 г, пептон – 5 г, дрожжевой экстракт – 3 г, MgSO4 – 0,2 г, K2HPO4 – 1 г, глюкоза – 5 г, конго-рот – 3 г. Концентрацию указанных компонентов также была подобрана экспериментальным путем.

Способ приготовления – все компоненты смешивали и доводили до кипения. Затем автоклавировали в течение 20 минут при 112° С. pH готовой среды накопления – 7,1. Готовая среда – насыщенного красного цвета.

С целью определения специфичности, разработанных нами сред накопления, был проведен контрольный посев бактерий-ассоциантов других видов и родов. Посевы культивировали в термостате в течение 24 ч. при Т- 28ºС: A. salmonicida АТСС 33658, Ps. putida №12633, Ps. fluorescens №13525, Y. ruckeri №6, Y.enterocolitica; при Т – 37 ºС: Ps. aeruginosa №128, A. hydrophila ATCC 49140, A. sobria ATCC 9071, A. caveae ATCC 12633, P. mirabilis №523, Kl. pneumonia №4463, E. coli №4 (табл.1).

Таблица 1 – Определение специфичности жидкой среды накопления A.Sl.1-УГСХА и дифференциально-диагностической среды A.Sl.2-УГСХА

№ п/п Вид бактерий Рост на жидкой среде A.Sl.1-УГСХА Контроль на МПБ Рост на плотной среде A.Sl.2-УГСХА Контроль роста на чашках Петри с МПА
1. A. salmonicida АТСС 33658 Рост бактерий, помутнение бульона, изменение цвета среды с зеленого на желтый Наличие роста, помутнение бульона. мелкие, округлые, черного цвета, размером 0,2-0,5 мм, с гладкой поверхностью. Цвет среды рядом с колониями изменяется на черный. +
2. A. hydrophila АТСС 49140 Рост бактерий, помутнение бульона, изменение цвета среды с зеленого на желтый Наличие роста, помутнение бульона Колонии крупные, диаметром до 1 мм, с гладкой поверхностью светлые, цвет среды красный. +
3. A. sobrea АТСС 9071 Рост бактерий, помутнение бульона, изменение цвета среды с зеленого на желтый Наличие роста, помутнение бульона мелкие, округлые, черного цвета, размером 0,5-0,7 мм, с гладкой поверхностью. Цвет среды рядом с колониями изменяется на черный. +
4. A. caviae АТСС 15468 Рост бактерий, помутнение бульона, изменение цвета среды с зеленого на желтый Наличие роста, помутнение бульона Колонии мелкие, диаметром до 0,7 мм, с гладкой поверхностью светлые, цвет среды красный. +
5. Ps. aeruginosa №128 Отсутствие роста, цвет среды не изменился. Наличие роста, помутнение бульона Колонии крупные, с гладкой поверхностью светлые, цвет среды красный. +
6. Ps. putida №12633 Отсутствие роста, цвет среды не изменился. Наличие роста, помутнение бульона Колонии крупные, с гладкой поверхностью светлые, цвет среды красный. +
7. Ps. fluorescens №13525 Отсутствие роста, цвет среды не изменился. Наличие роста, помутнение бульона Колонии крупные, с гладкой поверхностью светлые, цвет среды красный. +
8. P. mirabilis №523 Рост бактерий, помутнение бульона, изменение цвета среды с зеленого на желтый Наличие роста, помутнение бульона Колонии крупные, с гладкой поверхностью светлые, цвет среды красный. +
9. Y. ruckeri №6 Отсутствие роста, цвет среды не изменился. Наличие роста, помутнение бульона Колонии крупные, с гладкой поверхностью светлые, цвет среды красный. +
10. Y. enterocolitica Рост бактерий, помутнение бульона, изменение цвета среды с зеленого на желтый Наличие роста, помутнение бульона Колонии крупные, с гладкой поверхностью светлые, цвет среды красный. +
11. Kl.pneumonia №4463 Отсутствие роста, цвет среды не изменился. Наличие роста, помутнение бульона Колонии крупные, с гладкой поверхностью светлые, цвет среды красный. +
12. E. coli №4 Рост бактерий, помутнение бульона, изменение цвета среды с зеленого на желтый Наличие роста, помутнение бульона Колонии крупные до 2 мм в диаметре, округлые, имеют серый цвет. +

Этапы исследования по разработанной нами схеме.

Исследуемую пробу воды в количестве 1 мл вносят в накопительную среду A.Sl.1- УГСХА объемом 4-5 мл и помещают в термостат на 18 ч при температуре 28°С. На жидкой накопительной среде бактерии рода Aeromonas дают положительную реакцию, характеризующуюся изменением цвета среды с зеленого на желтый, а также помутнением субстрата и образованием осадка. Затем из жидкой среды накопления, бактериологической петлей делается посев на плотную дифференциально-диагностическую среду A.Sl.2-УГСХА и инкубируются 18 ч при температуре 28ºС.

На среде A.Sl.2-УГСХА бактерии A. salmonicida образуют колонии округлой формы, размером 0,5-1 мм черного цвета, цвет среды вокруг колоний также чернеет.

Выросшие на селективной среде A.Sl.2-УГСХА колонии параллельно исследуют по тестам – на желатиназную активность, наличие нитратредуктазы, подвижность, OF-тест, а также пересевают отдельно стоящие колонии на МПА для последующего определения окраски по Граму и микроскопии, наличия каталазной и оксидазной активности.

Производят окраску по Граму и микроскопию. Клетки A. salmonicida выявляются как грамотрицательные палочки.

Для определения ферментов оксидазы и каталазы производят посев выросших на среде A.Sl.2-УГСХА колоний на чашки Петри с мясопептонным агаром. После инкубирования при 28ºС в течение 18 ч на поверхность выросших на мясопептонном агаре колоний наносят 1% раствор 2-N-диметилпарафенилендиамина для определения оксидазы и 3% раствор перекиси водорода для определения каталазы. A.salmonicida является оксидазоположительной (покраснение реактива в течение 20 сек) и каталазоположительной (образование пузырьков газа).

Определяют подвижность методом укола в столбик застывшего 0,3% мясопептонного агара. После инкубирования в течение 18 ч при 28ºС проводят учет результатов. Бактерии A. salmonicida неподвижны (наличие роста микроорганизмов на полужидком агаре только по линии укола). Исследуют способность восстанавливать нитраты в нитриты. Для этого производят посев при помощи бактериологической петли в МПБ с нитратом калия. После инкубирования при 28ºС 18 ч в пробирки добавляют реактив – дистиллированная вода с крахмалом и йодистым калием и 10% водный раствор хлористоводородной кислоты. В результате происходит темно-синее окрашивание среды, т.к. A. salmonicida способна к нитратредуктазе.

Уколом производится посев в пробирки с тестом на наличие желатиназы. После инкубирования в течение 18 ч при 28ºС проводят учет результатов. Бактерии A. sаlmonicida разжижают желатин (среда в засеянной пробирке жидкая, в контрольной пробирке среда загустевает).

Для исследования способности микроорганизмов к ферментации глюкозы в аэробных и анаэробных условиях готовят среду Хью-Лейфсона. После инкубирования 24-48 ч при Т=28ºС проводят учет результатов, A. salmonicida способна к ферментации глюкозы как в аэробных, так и в анаэробных условиях (изменение цвета в пробирках с зеленого на желтый как в аэробных условиях, так и в анаэробных условиях).

В результате использования данной схемы при исследовании 97 проб воды из объектов водной среды г. Ульяновска и Ульяновской области нами было выделено 17 штаммов A. salmonicida.

Список литературы / References

  1. Головина, Н. А. Ихтиопатология / Н. А. Головина, Ю. А. Стрелков, В. Н. Воронин, П. П. Головин, Е. Б. Евдокимова, Л. Н. Юхименко. Под ред. Н. А. Головиной, О. Н. Бауера. — М.: Мир, 2003. — 448 с.: ил.
  2. Инструкция о мероприятиях по профилактике и мерам борьбы с фурункулезом лососевых рыб от 26.11.1997 №13-4-4/1090. – URL: http://www.cap.ru/home/65/aris/bd/vetzac/document/402.html (дата обращения: 28.03.2017).

Список литературы на английском языке / References in English

  1. Golovina, N. A. Ihtiopatologija [Ichthyopathology] / N. A. Golovina, Ju. A. Strelkov, V. N. Voronin, P. P. Golovin, E. B. Evdokimova, L. N. Juhimenko. Pod red. N. A. Golovinoj, O. N. Bauera. — M.: Mir, 2003. — 448 p.: il. [in Russian]
  2. Instrukcija o meroprijatijah po profilaktike i meram bor’by s furunkulezom lososevyh ryb ot 26.11.1997 №13-4-4/1090 [Instruction on measures for prevention and control of salmonid furunculosis]. – URL: http://www.cap.ru/home/65/aris/bd/vetzac/document/402.html (accessed: 28.03.2017). [in Russian]

Leave a Comment

Your email address will not be published. Required fields are marked *

Лимит времени истёк. Пожалуйста, перезагрузите CAPTCHA.