Genotyping of mutations in KRAS, NRAS and BRAF genes in colorectal cancer by mass spectrometry

Колоректальный рак (КРР) представляет собой злокачественное новообразование, развивающееся из эпителия толстой и прямой кишки

По данным статистики в России на 2022 год, зарегистрировано примерно 65 000 новых случаев КРР, большинство пациентов с впервые выявленным КРР – люди старше 40 лет. По уровню смертности КРР в России также находится на втором месте среди всех онкологических заболеваний

В основе патогенеза колоректального рака (КРР) лежит активация пути рецептора эпидермального фактора роста (EGFR). Этот сигнальный путь играет ключевую роль в регуляции различных клеточных процессов, связанных с канцерогенезом. Активация EGFR приводит к стимуляции роста опухоли, ингибированию апоптоза, сосудистой пролиферации, а также инвазии и метастазированию опухолевых клеток.

Сигнальный каскад, инициируемый EGFR, включает малые ГТФазы семейства RAS (HRAS, KRAS и NRAS) и киназы семейства RAF (ARAF, BRAF и CRAF). В этом каскаде белки RAS играют роль молекулярных переключателей, активирующих дальнейшие сигнальные пути, включая киназы RAF, которые, в свою очередь, запускают серию фосфорилирующих реакций, приводящих к изменениям в клеточном ядре и активации генов, связанных с клеточной пролиферацией и выживанием.

Гены KRAS и NRAS играют значительную роль в процессах метастазирования опухоли, и наличие мутаций в этих генах является основным предиктором резистентности опухоли к терапии EGFR-ингибиторами

Мутации в гене KRAS выявляются в 24-43% случаев КРР, что делает их одними из наиболее частых генетических изменений при этом заболевании

Таким образом, мутации в генах KRAS, NRAS и BRAF являются важными факторами, определяющими биологическое поведение и клинические характеристики КРР, и служат потенциальными мишенями для таргетной терапии

В настоящее время анализ на наличие мутаций в генах BRAF, NRAS и KRAS включён во все клинические рекомендации по диагностике и лечению КРР. Этот анализ имеет важное значение для определения прогноза течения заболевания и чувствительности опухоли к лекарственным средствам, особенно к терапии EGFR-ингибиторами. Определение мутационного статуса этих генов позволяет врачам выбрать наиболее эффективные стратегии лечения и повысить качество жизни пациентов

Для рутинного обнаружения точечных мутаций в генах KRAS и BRAF может быть применен широкий спектр молекулярно-генетических методов: секвенирование по Сэнгеру, массовое параллельное секвенирование, полимеразная цепная реакция (ПЦР) с использованием TaqMan-зондов (TaqMan PCR), цифровая ПЦР (ddPCR) и масс-спектрометрия с матричной лазерной десорбцией-ионизацией

Генотипирование с помощью масс-спектрометрии (MALDI TOF) основано на принципе детекции «удлиняющих» праймеров. Пробоподготовка включает в себя несколько этапов: мультиплексная ПЦР-реакция, очистка полученного продукта, ПЦР-реакция «удлинения» праймеров, ионизация и анализ получившихся спектров. Таким образом, при оценке разницы по массе одного нуклеотида в массе «удлиняющих» праймеров определяется соответствующая аллель

Используя программное обеспечение Assay Design Suite, нами были подобраны праймеры для мультиплексной панели для выявления статуса мутаций в генах KRAS, NRAS и BRAF, которая может использоваться для скрининга пациентов с КРР, что позволит проводить раннюю диагностику и более эффективно подбирать схему таргетного лечения.

Цель исследования – апробирование разработанной мультиплексной панели для выявления мутаций в генах KRAS, NRAS и BRAF с использованием метода масс-спектрометрии на генетическом анализаторе MassArray Analyzer 4.

2.1. Образцы

В качестве отрицательного контроля использовали геномную ДНК U-937 («СибЭнзайм», Россия), не имеющую мутаций в генах KRAS, NRAS и BRAF.

В качестве положительных контролей использовали искусственно синтезированные образцы, содержащие исследуемые мутации генов KRAS, NRAS и BRAF. Данные генетические конструкции были получены методом сайт-направленного мутагенеза, последовательность конструкций подтверждали секвенированием по Сэнгеру. Для определения относительной чувствительности были приготовлены смешанные контрольные образцы, содержащие 10%, 5%, 1%, 0,5% мутантного аллеля. Концентрация мутантного и нормального аллелей в смеси составляла 5 нг/мкл.

Образцы ДНК, выделенные из опухолевой ткани (злокачественное новообразование кишки) c известным генотипом были получены в РОНЦ им. Н.Н. Блохина (42 образца) для подтверждения специфичности разработанной панели при работе с фрагментированной ДНК.

2.2. Дизайн праймеров

Мутации генов KRAS, NRAS и BRAF были выбраны в соответствии с Клиническим рекомендациями

2.3. Мультиплексное генотипирование

Подготовку и анализ образцов проводили с помощью комплекта реагентов "PCR Reagent Set, Medium" ("Agena Bioscience", США) согласно инструкции к набору. Мультиплексное генотипирование проводили на автоматизированном генетическом анализаторе MassARRAY Analyzer 4 ("Agena Bioscience", США). Процесс генотипирования состоит из ряда последовательных этапов:

1. Мультиплексная ПЦР;

2. SAP-реакция;

3. iPlex-реакция;

4. Перенос образцов на спектро-чип и ионизация на приборе MassARRAY Analyzer 4;

5. Анализ полученных результатов с помощью программного обеспечения "MassARRAY Typer 4.0".

В ходе 1 этапа (мультиплексная ПЦР) были получены ампликоны, содержащие исследуемые SNP. В качестве образца использовали ДНК-матрицу, с концентрацией 5 нг/мкл. ПЦР проводили в 96-луночных планшетах объёмом 0,2 мл на в амплификаторе "T100 ThermalCycler" ("BioRad", США) согласно следующей программе: первичная денатурация – 95 ºС 5 мин, далее 45 циклов амплификации в условиях: 95 ºС 30 с, 62 ºС 45 с, 72 ºС 60 с, затем инкубировали пробирки при 72 ºС 3 мин.

На 2 этапе (SAP-реакция) происходит дефосфорилирование не включенных в ампликоны дезокситрифосфатов (dNTP) щелочной фосфатазой (SAP, Shrimp alkaline phosphatase). К полученному на 1 этапе ПЦР-продукту добавляли SAP-буфер и SAP Enzyme (0,5 единиц на 1 образец), затем планшет центрифугировали и инкубировали при 37 ºС 40 минут, а затем прогревали при 85 ºС 5 минут.

3 этап – iPlex-реакция (реакция удлинения), в ходе которого происходит удлинение праймеров UEP путём включения модифицированного дидезокситрифосфата (ddNTP) с модифицированной массой, комплементарного нуклеотиду, находящемуся в полиморфной позиции каждого SNP. К очищенному на 2 этапе ПЦР-продукту добавляли смесь удлиняющих праймеров, iPlex-буфер, iPlex-фермент и смесь модифицированных ddNTP. Амплификацию проводили по следующей программе: первичная денатурация – 95 ºС 30 с, далее 40 циклов амплификации в условиях: 95 ºС 5 с, 50 ºС 10 с, 70 ºС 10 с, затем инкубировали пробирки при 72 ºС 3 мин.

К полученному ПЦР-продукту в объёме 9 мкл добавляли 41 мкл стерильной деионизированной воды, затем центрифугировали планшет в течение 1 минуты.

Для переноса образцов на спектро-чип, планшет с ПЦР-продуктом помещали в модуль для подготовки чипов "Chip prep module", в котором проходит очистка аналита с помощью смолы и автоматическое нанесение очищенного аналита на спектро-чип.

После нанесения образцов спектро-чип автоматически переносится в рабочую камеру генетического анализатора MassArray Analyzer 4, где происходит процесс ионизации и получение масс-спектров.

Для анализа масс-спектров в реальном времени, а также для первичной обработки и документирования результатов экспериментов использовали программное обеспечение "MassArray Typer 4.0" ("Agena Bioscience", США).

Статистическая обработка данных осуществлялась с помощью стандартными методами математической статистики с помощью программы MS Office Excel, результаты определялись статистически значимые при р< 0,05.

Принцип генотипирования с помощью системы MassArray основан на амплификации ДНК с помощью ПЦР, в результате чего образуются копии как мутантных аллелей, так и нормальных аллелей. В результате iPlex-реакции происходит удлинение пролонгирующего праймера с использованием модифицированных ddNTP – А, C, G, T, каждый из которых имеет разную массу, что приводит к получению ампликонов с разными массами в зависимости от статуса мутации, и впоследствии обнаруживается с помощью масс-спектрометрии.

При наличии в образце ДНК мутации образуется два пика: пик мутантного аллеля и пик аллеля дикого типа. Соотношение площадей под кривой пиков аллели дикого типа и пиков мутантного аллеля является количественной мерой процентного содержания мутантных аллелей.

Для определения специфичности панели были проанализированы отрицательные образцы, представляющие собой разведения геномной ДНК U-937, не содержащей искомые мутации. В результате в исследуемых образцах были получены одиночные пики, по массе соответствующие нормальной аллели. Расчет уровня специфичности был определен путем вычисления отношения интенсивности пиков ПЦР-продукта к неспецифичным пикам с учетом значения соотношения сигнала к шуму (SNR) в 10 контрольных образцах, которое рассчитывается для каждого пика в программном обеспечении "MassArray Typer 4.0". Значения SNR находились в пределах 9,1-35,9, т.е. доля специфичного продукта составляет как минимум 90% для любого из пиков.

Таким образом, все пики, соответствующие аллелям, включенным в панель, определяются однозначно, и специфичность составляет 100%.

Аналитическую чувствительность анализа определяли путем серии экспериментов с использованием контрольных смешанных образцов определенной концентрации мутантного аллеля – 10%, 5%, 1%, 0,5% и оценивали по доле мутантных генотипов (значение call rate). В результате экспериментов нами было определено, что для выявления мутаций в генах KRAS, NRAS и BRAF, концентрация мутантного аллеля в образцах ДНК, должна составлять не менее 1%. Таким образом, выявленная чувствительность выше, по сравнению с исследованием, проведенном Arcilla M., et all (2011), была выявлена чувствительность 5% при обнаружении мутаций BRAF, 2,5% – для мутаций KRAS G12C, G12A, G13C и 10% для мутации KRAS G13D

Представленная панель была также апробирована на образцах ДНК, выделенных из FFPE-блоков, с известным генотипом. Всего было исследовано 42 образца ДНК. Данные генотипирования, полученные с помощью метода масс-спектрометрии полностью совпали с данными полученными в РОНЦ им. Н.Н. Блохина.

В исследуемых образцах наиболее часто встречающимися мутациями оказались мутации в гене KRAS (76,2%), мутации в гене BRAF были обнаружены в 23,8% случаев, мутации в гене NRAS не были обнаружены, что скорее связано с недостаточной выборкой образцов. Среди мутаций KRAS по частоте выявления преобладала мутация G12D (34,4%), второе место заняла мутация G12V (21,9%), а затем G13D (9,4%). Мутация G12C, с которой ассоциируется развитие лекарственной устойчивости была обнаружена только в 2 случаях (6,2%). Мутации G12R и G12A выявлены в 2 случаях, а мутации 3 (A59T, Q61H, Q61K) и 4 экзонов (A146T, A46P) – по 1 образцу (3,1%). Среди мутаций в гене BRAF преобладала мутация V600E (60%), также были определены мутации V600K и V600M (30% и 10% соответственно). Полученные результаты согласуются с данными, полученными в ходе других исследований

Высокий уровень специфичности и чувствительности свидетельствуют о способности разработанной панели строго специфично выявлять анализируемые мутации в мультиплексных реакциях при низких концентрациях мутантного аллеля, в образцах фрагментированной ДНК, а также в присутствии возможных ингибиторов. 

Разработанная нами панель имеет ряд существенных отличий от аналогичной панели iPLEX HS Colon Panel ("Agena Bioscience", США»), а именно - оптимальный выбор генов – KRAS, NRAS, BRAF, что соответствует Клиническим рекомендациям

Мутации в генах KRAS, NRAS и BRAF – наиболее значимые прогностические и терапевтические биомаркеры у пациентов с КРР. Оценка мутационного статуса генов KRAS, NRAS и BRAF является обязательной при назначении таргетной терапии, а также для прогнозирования течения заболевания.

Разработанная панель на основе автоматизированного метода MALDI-TOF MS на платформе MassArray позволяет провести одновременное мультиплексное высокоточное количественное генотипирование значимых мутаций в генах KRAS, NRAS и BRAF. Предлагаемая панель позволяет проводить одновременный анализ 84 мутаций в 19 образцах (с использованием 96-луночного планшета) за относительно короткий период времени за одну постановку. 

Результаты экспериментов показали высокий уровень специфичности (100 %) и аналитической чувствительности (выявление мутаций при 1% содержании мутантного аллеля в образце ДНК). Апробация на клинических образцах показала хорошие результаты при работе с фрагментированной ДНК, выделенной из FFPE-блоков и отсутствие неспецифических пиков, что говорит о высокой точности используемого метода.

Метод масс-спектрометрии характеризуется высокой степенью автоматизации и подходит для высокопроизводительного анализа большого количества образцов, что делает его пригодным для рутинной работы. Кроме того, MALDI-TOF MS на платформе MassArray представляет собой открытую платформу и позволяет добавлять дополнительные мутации, которые могут быть очень важны в будущем.