Analysis of tissue specificity of igf1 gene expression in rainbow trout yearlings
Analysis of tissue specificity of igf1 gene expression in rainbow trout yearlings
Abstract
The study analysed the tissue specificity of igf1 gene expression in rainbow trout yearlings raised in a closed water supply system. The research took into account the fish breeding season, as well as temperature conditions and combined lighting conditions. Expression was evaluated in the liver, muscles, heart, and brain using qPCR. It was found that the level of igf1 mRNA varies significantly between tissues: maximum values were observed in the liver, while in other tissues the level of expression was much lower. Correlation analysis showed a close relationship between morphometric parameters, but their relationship with igf1 expression levels was weak or unreliable. The obtained data confirm the tissue specificity of igf1 gene expression in rainbow trout yearlings and reflect igf1 expression levels in accordance with organised breeding conditions.
1. Введение
Исследование экспрессионного профиля гена igf1 представляет собой актуальную задачу ввиду его прямого участия в росте и развитии рыб в эмбрио- и онтогенезе , , . Уровень циркулирующего инсулиноподобного фактора роста и гормона роста в крови выступает маркером и медиатором роста, интегрируя сигналы от лиганда соматотропина и метаболического статуса. Экспрессия и действие igf1 у радужной форели зависят от сочетания гормональных (GH) и питательных сигналов, а роль igf1 в качестве ключевого медиатора роста подтверждается как на уровне клетки, так и в организме в целом , .
Ген igf1 и его паралог igf2 опосредуют анаболические эффекты соматотропина на рост рыб, при этом перераспределяют между собой нагрузку в зависимости от периода жизни радужной форели и условий ее выращивания. Так, в эмбриогенезе отмечаются высокие уровни мРНК гена igf2, однако более высокая температура инкубации приводит к увеличению экспрессии igf1, а также других генов роста (gh1, igfr1a/b), особенно на стадии выклева . На уровни мРНК гена igf1 в тканях, где возможна его экспрессия, могут влиять различные факторы. При повышении температуры происходит активация транскрипции igf1, что определяет адаптивные возможности эмбриона к изменяющимся условиям окружающей среды уже на ранних стадиях развития. . Так, при осморегуляции, повышается экспрессия igf1 в жабрах, а естественное и искусственное изменение фотопериода не влияет существенно на средние уровни плазменного IGF-1 . При негативных катаболических условиях, таких как голодание, хронический стресс на фоне плотных посадок при выращивании, у радужной форели наблюдаются физиологические и молекулярные изменения, которые ведут к снижению печеночной продукции инсулиноподобного фактора роста или снижению его действия через приобретённую резистентность к соматотропину и/или смену метаболического приоритета от роста к выживанию , . При содержании рыб преднерестового возраста при круглосуточном освещении и ночном кормлении уровень транскрипции igf1 повышается в печени и мышцах , а у молоди радужной форели таких изменений не происходит, более того увеличенный фотопериод вызывает стресс и иммуносупрессию .
Большинство исследований экспрессии инсулиноподобного фактора роста у радужной форели проведено либо в раннем возрасте, либо у зрелых особей. Поэтому в этом исследовании мы сфокусировали внимание на группе рыб годовалого возраста, определили уровни экспрессии гена igf1 и проанализировали возможное влияние внешних факторов на уровни его мРНК.
2. Методы и принципы исследования
Годовики радужной форели породы рофор содержались в Федеральном селекционно-генетическом центре рыбоводства при температуре выращивания 13°С и комбинированном освещении — естественное освещение с 9:00-16:00, искусственный приглушенный свет с 16:00-9:00. Суточная норма кормления на особь составляла 3.5 г. Для исследования были отобраны здоровые рыбы (n=50) в конце февраля. Анальгезия и седация рыб была произведена в отдельном резервуаре с применением трикаина метансульфоната. Были сняты размерно-весовые показатели: масса тела, длина тела до конца хвостового плавника, длина тела до конца чешуйчатого покрова, длина головы, наибольшая высота тела и толщина тела. От каждой особи были взяты образцы ткани сердца, печени, мышечной ткани и мозг целиком. Полученный биоматериал был зафиксирован РНК-стабилизатором IntactRNA («Евроген», Россия). Экстракция тотальной РНК проводилась коммерческим набором «ЛИРА+» («Биолабмикс», Россия). Концентрация и чистота растворенной РНК измерялась спектрофотометром NanoDrop2000с (Thermo Fisher Scientific, США). Синтез кДНК выполнялся с использованием коммерческого набора «M-MuLV-RH» («Биолабмикс», Россия), согласно протоколу производителя. Подбор праймеров выполнялся через онлайн-сервис PrimerBLAST базы данных NCBI (таблица 1).
Таблица 1 - Последовательности праймеров, для секвенирования и оценки относительного уровня экспрессии
Название гена | Последовательность | Длина фрагмента п.н. |
IGF1 | F – GCTTCCAGAGTTGCGAGCTA R – CATGTCTGTGTGGCGTTGTG | 100 |
G6PD | F – TCAAAGAGGGTCGGTTTCCG R – ACCCATCCCTCTTCCTCTCC | 87 |
Для постановки ПЦР в реальном времени использовали готовый микс от компании Биолабмикс «БиоМастер HS-qPCR SYBR Blue(2×)» («БИОЛАБМИКС», Россия) согласно инструкции производителя. Каждый образец ставился в трех повторностях. ПЦР в режиме реального времени проводили на приборе Bio-Rad CFX Opus 96 («Bio-Rad», США, программное обеспечение CFX Maestro Software) по протоколу амплификации: предварительная денатурация при 95,0 °C — 5 минут, далее следовали 40 циклов: 95°C 15 секунд, 60,0 °C 15 секунд, 72,0 °C 30 секунд. Расчет ∆Ct, ∆∆Ct проводились по методике Livak . Для оценки достоверности использовался критерий Краскела-Уоллиса.
3. Основные результаты
Для сопоставления данных об уровнях мРНК гена igf1 с метрическими показателями рыб был выполнен анализ корреляционных связей между размерно-весовыми показателями (Рисунок 1).
Рисунок 1 - Корреляционные связи размерно-весовых показателей годовиков радужной форели:
А – длина тела по Смиту; B – длина тела до конца чешуйчатого покрова; C – длина головы; D – высота тела; E – толщина тела; F – масса тела; Х – недостоверное значение корреляции
Примечание: цветовая шкала отображает значения корреляции
Всего было собранно метрических данных и биологического материала от 50 особей радужной форели. Результаты анализа относительного уровня экспрессии гена igf1 в мышцах, сердце, печени и мозге представлены на рисунке 2.
Рисунок 2 - Относительный уровень экспрессии гена igf1 у годовиков радужной форели
Примечание: n=50
Чтобы установить связь уровня экспрессии в разных тканях с метрическими данными был проведен корреляционный анализ (Рисунок 3).
Рисунок 3 - Корреляционные связи размерно-весовых показателей относительного уровня экспрессии у годовиков радужной форели:
А – длина тела по Смиту; B – длина тела до конца чешуйчатого покрова; C – длина головы; D – высота тела; E – толщина тела; F – масса тела; G – относительный уровень экспрессии IGF1 в ткани печени; H – относительный уровень экспрессии igf1 ткани сердца; I – относительный уровень экспрессия igf1 в мышечной ткани; J – относительный уровень экспрессия igf1 в мозге
4. Заключение
Проведенное исследование показало, что у годовиков радужной форели, содержавшихся в зимний период при температуре 13 °C и укороченном естественном фотопериоде в комбинировании с приглушенным искусственным освещением, экспрессия гена igf1 демонстрирует чётко выраженную тканеспецифичность. Максимальный уровень транскрипции был зарегистрирован в печени — основном органе синтеза инсулиноподобного фактора роста у рыб, тогда как в мышцах, сердце и мозге экспрессия оставалась низкой и статистически сравнимой между собой.
Несмотря на высокую взаимосвязанность морфометрических характеристик рыб, их связь с уровнем экспрессии igf1 в разных тканях оказалась неоднозначной. В печени обнаружена средняя отрицательная корреляция, что может отражать снижение чувствительности соматотропной оси или перераспределение метаболических ресурсов при данных параметрах освещения. Положительные корреляции, выявленные в мышцах и мозге, статистически не подтверждены и требуют дальнейшего изучения.
Полученные результаты указывают на то, что в условиях зимнего выращивания (умеренная температура и ограниченный фотопериод) регуляция igf-зависимых процессов у годовиков радужной форели определяется сочетанием сезонных физиологических адаптаций и тканеспецифичных механизмов экспрессии. Эти данные подчеркивают необходимость учитывать температурно-световые условия при интерпретации активности компонентов GH–IGF оси и планировании дальнейших исследований роста рыб в УЗВ.